Gene Design

Which codon

Uso di codoni - AGA o CGT - questo é il problema!

Il codice genetico offre come opzione diversi codoni corrispondenti a 18 dei 20 aminoacidi che compongono la sequenza primaria di una proteina. Tuttavia i possibili codoni non vengono utilizzati con la stessa ricorrenza in specie differenti, indicando una chiara preferenza per determinati codoni, e divenne presto evidente che gruppi di codoni specie specifici sono in relazione con l´espressione dell´mRNA e di conseguenza con la produzione della proteina. É opinione comune che i codoni utilizzati piú frequentemente corrispondano ai pool piú abbondanti di tRNA; perció l´impiego di questi codoni evita una carenza del tRNA disponibile, accelera la traduzione e spesso incrementa sensibilmente il livello di espressione eterologa.

Contenuto di GC

L´espressione genica é regolata dalla complessa interazione di attivitá trascrizionale, disponibilitá di tRNA e stabilitá dell´ mRNA. Il terzo fattore, tra altri, puó essere condizionato dalla composizione dei nucleotidi, piú in particolare dal contenuto di GC. Konu et al. (J Mol Evol, 2002) hanno rilevato che il livello di espressione dell´ mRNA nei topi e nei ratti é correlato alla presenza di G o C in terza posizione nei codoni. CG or atL´influenza del contenuto complessivo di GC sul livello di espressione é stato riscontrato anche negli insetti, (Shieldset al.,1988), nel lievito (Woo, et al. 2002; Outchkourov et al. 2002; Gurkan et al., 2003), nelle piante (Perlak et al. 1991; Strizhov et al. 1996) e in vari geni di mammifero (Graf et al 2000, Graf et al 2006).

Strutture dell´ mRNA

Reduce secondary structureÉ ormai dato di fatto che stabili e complesse strutture secondarie dell´ mRNA possano arrestare l´inizio della trascrizione o l´intero processo di trascrizione (e.g. Wilkstrom et al 1992, Gross et al 1990; Chang et al 1995; ...). Sebbene sia complesso predire le strutture secondarie dell´mRNA, é piuttosto facile eliminarle evitando ripetizioni inverse.

Motivi ospite specifici

Indipendentemente dall´ospite che si sta usando per l´espressione le sequenze wild type sono nella maggior parte dei casi inadatte a raggiungere il massimo di espressione. Elimina le sequenze di Shine Dalgarno, i siti di splice, i segnali di poliadenilazione o qualunque motivo che agisce in cis entro le open reading frame del wild type. Metti a punto un progetto, definisci i pattern di sequenza da evitare e minimizza la frequenza con cui un certo pattern compare.Se ad esempio un gene di mammifero viene trasferito in E.coli per l´espressione eterologa di una proteina le sequenze di Shine Dalgarno presenti nell´open reading frame del wild type potrebbero influenzare negativamente il livello di espressione.
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