基因新闻 第131页

基因编辑是一种用于精确操纵细胞和生物体内基因和基因组的技术。近年来正迅速影响着植物基因组学研究领域，逐渐受到学术界及全社会的关注。生物谷在将于11月10日在上海好望角大酒店举办《2017植物基因组与基因编辑学术研讨会》。为大家提供一个交流技术和前沿信息的平台，推动植物基因编辑领域的发展。
 
以下是小编为大家带来的福利哦，部分与会嘉宾的摘要分享！
 
 
【陈其军】中国农业大学生物学院

演讲题目：高特异性和高通量植物CRISPR/Cas9基因组和碱基编辑技术应用研究

1.从另一个视角（文献计量学）分享CRISPR革命浪潮的气势；
2.报告我们建立的基因组和碱基编辑工具箱；
3.报告我们在研究过程中遇到的一序列意外的发现，包括在拟南芥中的高频率脱靶现象以及在下一代脱靶加重现象；
4.报告高特异性Cas9在植物中的效率及特异性；
5.介绍使用两套互补干扰CRISPR系统实现拟南芥多基因敲除的途径；
6.介绍实现玉米高通量基因组和碱基编辑的途径。
 
 
 
【金双侠】华中农业大学植物科学技术学院

演讲题目：多倍体棉花的基因组编辑研究进展

As one of gene editing technologies, the CRISPR/Cas9 system has exerted its broad application from prokaryotes to eukaryotes. Its robustness, costlessness and high efficiency give it obvious advantages and potential compared to both ZFN and TALENs gene editing technologies. Up to now, it had conspicuous effects in many plants, including major crops like rice, wheat and zea maize. As an important economic crop, the widely cultivated upland cotton is an allotetraploid with a complex genome structure and most genes have at least two copies that originated from A and D sub-genome, respectively. This feature always results in no obvious phenotype in gene functional analysis by RNA interference strategy, because of gene redundancy. There are no sufficient mutants in cotton for advanced gene function research. In this study, we utilized a CRISPR/Cas9 system that can generate more than one sgRNAs in one vector for genome editing at multiple sites. An exogenously transformed gene dsRFP and an endogenous gene GhCLA1 were chose as CRISPR/Cas9 knock out targets. For each gene, at least a pair of sgRNAs, driven by a cotton native type Ⅲ RNA polymerase promoter-pGhU6.9, were designed in the coding (or exons) regions. Through Agrobacterium-mediated transformation, the regenerated T0 plants exhibited obvious phenotype for both target genes. For RFP, the regenerated plants had vanished red fluorescence. GhCLA1 targeting plants gained obvious albefaction from embryo to young seedlings stages. Gene mutations were verified with Sanger sequencing and T7E1 enzyme. Large deletions were observed between the paired target sites. Moreover, these albefaction plants only arose in bioallelic mutation of all copies of the target gene. All these results demonstrated that the sgRNA guided Cas9 had a great potential in cotton for genome editing.  

 
 
【徐明良】中国农业大学

演讲题目：玉米抗病QTL克隆及标记辅助抗性改良

玉米病害是玉米生产的主要限制因子，每年造成的产量损失约占总产的10%。近年来，由于极端气候频发，秸秆还田、机械化收获等因素的影响，我国玉米病害呈越演越烈之势。有别于禾谷类其他作物，如水稻、玉米，大多数重要玉米病害都是由坏死营养型病原菌引起，相应的玉米抗病性呈数量性状遗传，由多个抗病位点控制。虽然数量性状抗病位点只能使抗性适度提高，但这类抗性稳定，广谱且可持续，在玉米育种中有重要的利用价值。如果将多个数量抗性位点聚合可以达到对某个病害高度的抗性。为了从遗传上改良玉米的抗病性，我们与玉米育种家合作，收集、筛选优良抗源，组配定位群体，开展图位克隆。迄今为止，我们已克隆了9个重要玉米抗病QTL基因，分别抗丝黑穗病、茎腐病、穗粒腐病、甘蔗花叶病毒病、粗缩病、灰斑病等。根据抗病基因序列信息，我们在玉米种质资源中挖掘优良抗病等位基因，发展分子标记，利用分子标记辅助选择将优良抗病等位基因导入到玉米自交系中，培育抗性改良的优良自交系。目前，我们发掘的优良抗病基因已广泛用于我国玉米抗病育种。
 
 
【刘克德】华中农业大学

演讲题目：
CRISPR/Cas9-mediated genome editing efficiently creates specific mutations at multiple loci using one sgRNA in Brassica napus

Hong Yang1, Jia-Jing Wu1, Ting Tang1, Ke-De Liu1*, Cheng Dai1*
1. National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
Abstract
CRISPR/Cas9 is a valuable tool for both basic and applied research that has been widely applied to different plant species.  Nonetheless, a systematical assessment of the efficiency of this method is not available for the allotetraploid Brassica napus—an important oilseed crop. In this study, we examined the mutation efficiency of the CRISPR/Cas9 method for 12 genes and also determined the pattern, specificity and heritability of these gene modifications in B. napus. The average mutation frequency for a single-gene targeted sgRNA in the T0 generation is 65.3%. For paralogous genes located in conserved regions that were targeted by sgRNAs, we observed mutation frequencies that ranged from 27.6% to 96.6%. Homozygotes were readily found in T0 plants. Meantime, we developed a simple visual screen for mutant material in plant species, allowing us to quickly obtain mutated plants or tissue. We observed mutation frequencies that ranged from 7.4% to 100% in Arabidopsis and B. napus, respectively. Cas9-free mutants were sufficiently isolated from T2 generation in Arabidopsis and B. napus by visual screening. Homozygotes, bi-alleles, and heterozygotes were stably inherited as classic Mendelian alleles in the next generation (T3) without any new mutations or reversions. Moreover, no mutation was found in the putative off-target sites among the examined plants or tissue. The method allows us for effectively isolating positive transgenic plants and Cas9-free heritable CRISPR mutants in many plant species, which open many doors for biotechnological applications in oilseed crops.

Keywords: CRISPR/Cas9, gene editing, B. Napus.

三、注册收费
 

基因编辑是一种用于精确操纵细胞和生物体内基因和基因组的技术。近年来正迅速影响着植物基因组学研究领域，逐渐受到学术界及全社会的关注。生物谷将与11月10日到11日在上海好望角大酒店举办《2017植物基因组与基因编辑学术研讨会》，本次会议围绕植物基因组研究、植物基因编辑技术的研究应用情况、以及对基因编辑农作物的政策监管进行探讨。为大家提供一个交流技术和前沿信息的平台，推动植物基因编辑领域的发展。

会议特色：

2017年11月15日 讯 /生物谷BIOON/ –近日，刊登在国际著名杂志Nature Biotechnology上的一篇研究报告中，来自MIT的科学家开发出了一种新型纳米颗粒，这种纳米颗粒能够运输CRISPR基因编辑系统，并对小鼠机体的基因进行特异性修饰；因此研究人员就能够利用纳米颗粒来携带CRISPR组分，从而就消除了使用病毒的需要。

图片来源：MIT

利用这种新型的运输技术，研究者就能对大约80%的肝脏细胞进行特定基因的切割，这或许就能达到目前在成体动物中应用CRISPR技术的最佳成功率。 研究者Daniel Anderson教授说道，让我们非常激动的是，我们制造了这种特殊的纳米颗粒，其能被用来永久特异性地编辑成年动物机体肝细胞中的DNA；本文研究中，研究者所研究的一种名为Pcsk9的基因能调节机体胆固醇的水平，而人类机体中该基因的突变或许和一种名为家族性高胆固醇血症的罕见疾病有关，目前FDA批准的两种抗体药物能够抑制Pcsk9基因的表达，然而这些抗体药物需要在患者后半生中定期服用，而新型的纳米技术或能永久性地对该基因进行编辑，同时就为治疗这种罕见疾病提供了新的治疗思路。

靶向作用疾病

很多科学家都在尝试开发安全有效的方法来运输CRISPR所需的组分，其中包括DNA切割酶Cas9和一个短链RNA，其能够引导酶类进入基因组的特殊位点，指导Cas9来发挥切割作用。

在很多情况下，科学家们依赖于病毒来运输Cas9基因和RNA链，2014年，研究人员Anderson及其同事通过研究开发了一种新型的非病毒运输系统，利用CRISPR技术来有效治疗酪氨酸血症（一种肝脏疾病），然而这种运输技术需要进行高压注射，这就会对患者机体肝脏带来潜在的损伤作用。

后来，研究人员就通过将编码Cas9的信使RNA包裹到纳米颗粒中来替代病毒，从而就实现了不用高压注射也能够运输CRISPR的关键组分，利用这种技术，研究者就能够对大约6%的肝脏细胞进行基因靶向编辑，这就足以治疗酪氨酸血症了。这项研究中，研究人员利用纳米颗粒来运输Cas9和RNA导向链，并不需要病毒，为了能够有效运输RNAs，研究者首先必须对RNA进行化学修饰来保护其免于机体酶类的降解作用。

研究人员分析了Cas9和sgRNA（RNA导向链）形成的复合体的结构，目的在于阐明到底是RNA导向链的哪一部分能被化学修饰，还不干扰两个分子的结合，基于前期分析，研究者就开发并且检测了多种可能性的修饰组合。研究者Yin说道，我们能够利用Cas9和sgRNA复合体来作为一种引导工具，并进行测试来确保我们可以对70%的RNA导向链进行修饰，对其进行修饰并不会影响sgRNA和Cas9的结合，而增强化学修饰同样还会增强其二者结合的活性。

对肝脏进行重编程

随后研究人员将这些修饰后的RNA导向链（增强型的sgRNA）包裹入脂质纳米颗粒，此前研究者利用这种纳米颗粒将其它类型的RNA运输到肝脏中，而本文研究中他们将这些脂质纳米颗粒注射到了携带能编码Cas9的mRNA纳米颗粒的小鼠机体中。研究者重点对调节胆固醇水平的Pcsk9基因进行了研究，在超过80%的肝脏细胞中都能消除这种基因，从而就无法在这些小鼠中检测到Pcsk9蛋白的存在，被治疗的小鼠机体总胆固醇水平也会出现35%的下降。

目前研究人员正在寻找是否能利用该技术治疗其它肝脏疾病；研究者Anderson认为，一种能特异性关闭基因表达的完全合成性的纳米颗粒或许就能作为一种强大的工具，这并不仅仅是针对Pcsk9基因，还包括了其它疾病，肝脏是人体重要的器官，同时其也是很多疾病发生的来源，如果能实现对肝脏细胞中DNA的重编程，研究人员或许就能够有效遏制多种肝脏来源的疾病了；本文研究中，研究人员所开发的纳米技术新应用未来或能为基因编辑研究开辟多种途径。（生物谷Bioon.com）

原始出处：

Hao Yin, Chun-Qing Song, Sneha Suresh, et al.Structure-guided chemical modification of guide RNA enables potent non-viral in vivo genome editing. Nature Biotechnology (2017). nature.com/articles/doi:10.1038/nbt.4005

感冒了，去药房买药。难道基因疗法也能自己动手，简单获得？

基因疗法（gene therapy）可以修饰基因的表达，改变细胞的生物特征，在治疗疾病方面提供了现有疗法无法提供的潜力，因此，一时间风起云涌，方兴未艾。

大量的基因治疗的研究正在进行中，研究人员尝试用基因疗法治疗恶性肿瘤，遗传性疾病，传染病和其他疑难杂症和重大疾病。

其中最引人注目的基因编辑技术，CRISPR/Cas9，目前已经在治疗肺癌和遗传罕见病方面进行临床研究。

目前，FDA已经批准了的基因疗法包括：

但是，还有许多患者正在等待更多的基因疗法获批上市。因此，一些号称能自我动手（Do It Yourself，DIY）的基因疗法的试剂盒正在悄然在网上兴起。

上个月，一个居住在美国华盛顿的患者自己注射了还未获批的治疗艾滋病的基因疗法，然后将视频放到社交媒体上，引起了轩然大波。这个疗法由一家名不见经传的生物公司Ascendence Biomedical提供。

该公司计划在网上出售“研究化合物”。

显然，这个事件引起了FDA的注意。这个监管机构意识到，有必要对这种DIY基因疗法提出警告。

“这些产品的销售是违法的。 我们担心其中涉及的安全风险。”FDA在一份声明中表示。

FDA还表示，基因疗法产品由FDA下属的生物制品评估和研究中心（CBER）监管。基因治疗的临床研究需要在开始之前提交研究性新药申请（IND），基因治疗产品的销售需要提交生物制剂许可申请（BLA）并得到批准。

FDA已经意识到，焦急的患者可能会急不可待，对这些自己动手的基因治疗产品心动。但是， 销售未经批准的基因疗法属于违法行为，FDA警告说。

“消费者应确保他们正在考虑的任何基因疗法是已经获得批准或正在适当的监管下进行的研究。”FDA说。(生物谷Bioon.com）

2017年12月18日 讯 /生物谷BIOON/ –PTEN是我们熟知的肿瘤抑制蛋白，其能够保护细胞免于失控生长以及癌症的发生；近日，来自哥伦比亚大学医学中心的研究人员通过研究发现，蛋白PTEN或许有第二种不为人知的功能，其能够同CFTR蛋白相互协作来维持肺部组织健康，并有效清除潜在的危险感染，相关研究刊登于国际著名杂志Immunity上。

图片来源：www.bbc.co.uk

文章中，研究者解释了为何囊性纤维化患者非常容易患上呼吸道感染，25年前，研究人员就发现CFTR基因的突变会诱发肺部囊性纤维化，CFTR基因能表达产生CFTR蛋白帮助在细胞内外运输氯离子，如果没有这种离子运输的话，肺部中的粘液就会越来越粘厚，从而就很容易诱发肺部被细菌感染，尤其是假单胞菌，细菌的感染也会加速机体炎性反应的发生，从而导致持续性难以治疗感染性疾病的发生。

这项研究中，研究者发现，CFTR突变会通过一种完全不同的方式来促进感染进行；研究者Sebastian A. Riquelme博士表示，携带CFTR突变的细胞或许对细菌免疫反应较低，从而就会降低机体清除感染的能力，也会促进炎症扩张；这一点看起来非常有趣，因为其阐明了一种平行的解除管制的免疫学机制，这种机制会促进呼吸道破坏，这种效应远远超过了CFTR对粘液的效应。

当然了，这也是PTEN发挥作用的场所，研究人员并不清楚PTEN如何参与囊性纤维化的发病过程，如今通过对缺失PTEN的小鼠进行研究后研究人员发现小鼠对假单胞菌会产生严重的炎性反应，而且小鼠体内也会表现出像在囊性纤维化患者中出现的清除能力下降的表现。当PTEN位于肺部细胞和免疫细胞表面时，其能帮助有效清除假单胞菌，并且抑制炎症反应，但PTEN似乎只有在吸附到CFTR上才会表现出这样的作用。

在大多数囊性纤维化病例中，很少有CFTR能找到前往细胞表面的路，最后它们往往会失去联系从而让细菌变得更加疯狂。最新开发出的囊性纤维化药物常常会将突变的CFTR推向细胞表面，从而就能改善细胞内外氯离子通道的功能，减少粘液的堆积；本文研究发现“诱骗”无功能的CFTR进入到细胞表面似乎也是有益的，甚至异常的CFTR也能同PTEN协作来抵御机体感染。

研究者Riquelme博士表示，另外一种想法就是寻找能够直接改善PTEN膜抗炎性反应的药物，目前正在调查的有多种PTEN的启动子有望作为治疗囊性纤维化的新型抗癌疗法。本文研究提出了一种可能，即PTEN或许与囊性纤维化患者的胃肠癌发病风险增加直接相关；由于目前临床护理得到了明显改善，这些患者往往生活地比较好，然而如今胃肠癌患者的比例不断增加，有些研究就认为，CFTR或许就是一种肿瘤抑制子，当然了本文研究也提出了一种假设，CFTR的突变以及其配偶体PTEN的缺失或许会驱动囊性纤维化患者癌症的发生。

当然，后期研究人员将会以本文研究结果为基础，进行更为深入的研究来开发能有效治疗囊性纤维化患者的新型靶向性疗法。（生物谷Bioon.com）

原始出处：

Sebastián A. Riquelme, Benjamin D. Hopkins, Andrew L. Wolfe, et al.Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Attaches Tumor Suppressor PTEN to the Membrane and Promotes Anti Pseudomonas aeruginosa Immunity. Immunity (2017) doi:10.1016/j.immuni.2017.11.010

11月24日，杨辉博士研究组与北京大学胡家志研究员实验室合作，在Genome Biology杂志上发表的一篇论文首次证实，利用靶向染色体多个特定位点的单个sgRNA，在特定的染色体上造成多处DNA切割，可选择性地敲除整条染色体。这一发现为获得染色体敲除的动物模型以及非整倍体疾病的治疗提供了新思路。趁着这一热点，探索君开始了此次专访。

1获得新发现，是“一个美丽的意外”

相信很多人知道，CRISPR是近几年风靡科学届的新型基因编辑技术。先前，科学家们已经能够利用该技术实现基因删除、基因插入、大片段敲除和染色体易位。然而，整条染色体是否能通过CRISPR来敲除依然是个未解之谜。

“这可以说是一个美丽的意外，”对于自己的新发现，杨辉博士这样告诉探索君，“起初，我们只是打算研究Y染色体上的多拷贝基因，但却取得了令人惊奇的发现：敲除多拷贝基因Ssty1、Ssty2和Rbmy1a1都会导致雄性胚胎的性别转换。分析表明，性别反转的原因是由于多拷贝基因的编辑导致整个Y染色体丢失了，而不是因为多拷贝基因的敲除。进一步的研究证实，这种方法还可以敲除X染色体和常染色体，其中包括了与唐氏综合征有关的21号染色体。”

唐氏综合征是最常见的遗传疾病之一，由多一条21号染色体所造成。对于是否有望利用CRISPR技术来治疗这种疾病，杨辉博士谈到了以下几点障碍：1）能否在成体细胞中有效地敲除一条染色体（上述研究证实，CRISPR技术可敲除唐氏综合征患者的诱导性多能干细胞中的21号染色体）；2）如何特异性地敲除3条21号染色体中的一条而不破坏其他2条；3）如何确定靶细胞。这些问题都是实验室未来将研究的方向。

2结缘CRISPR，赶上了“天时地利人和”

除了这篇论文，2017年，杨辉博士团队还在EBioMedicine、Cell Research等杂志上发表了多项成果。谈起最初与CRISPR如何结缘，他说，这与现任中科院动物所基因工程技术研究组组长的王皓毅研究员密不可分。

2013年2月中旬，MIT Broad研究所的CRISPR先驱张锋团队在Science杂志上发表了一篇关键论文，首次证实了CRISPR技术能够编辑人类细胞的基因组。论文发表后，在MIT Whitehead研究所Rudolf Jaenisch教授实验室做博士后研究的王皓毅博士很快从张锋的实验室取得了质粒，开展其所擅长的研究，如，研究多能干细胞、用于小鼠建模等。

杨辉博士说，自己当时也在Jaenisch教授实验室做博士后研究，由于读博期间一直做基因修饰小鼠，包括克隆技术、单倍体干细胞技术，因此与王皓毅博士一拍即合。“很快，我们证明，通过CRISPR技术，能够高效地制作各种基因修饰小鼠。”

2013年5月2日，也就是短短3个月后，两人以共同第一作者的身份在Cell杂志上发表了一项合作成果。同年8月29日，Cell杂志再次刊登了他们的一篇合作论文。如此来看，对杨辉博士来说，与CRISPR的结缘可以说是赶上了“天时地利人和”。

如今， CRISPR技术已成为全球多领域科学家离不开的实验工具。杨辉博士说：“CRISPR技术的发展让科研变得更简单了。举例来说，由于该技术使得制作基因修饰小鼠的技术门槛、周期和成本都极大降低，因此，直接改变了研究者们的思维方式。以前，大家是先做细胞分子实验，再用基因修饰小鼠来验证功能；而现在，变成了先做基因修饰小鼠，观察表型，再做机制研究。”

采访中，他还打趣道：“CRISPR技术带来的改变可简单总结为：让博士们做实验更容易，结果更可靠，更容易毕业了。”

3未来10年，CRISPR定能攻克多种人类单基因遗传病

在2017年里，CRISPR技术在应用方面取得了多项突破进展，包括编辑人类胚胎（Nature-1；Nature-2）、攻克器官异种移植难题（Science）、化身图片存储工具（Nature）等等。

在CRISPR的各类应用中，治疗人类疾病已成为最受关注的方向。最近发表在Nature上的一项研究中，来自哈佛大学的David R. Liu教授利用基于CRISPR技术的系统成功破坏了导致小鼠耳聋的基因突变，这或将使治疗遗传性耳聋迎来转折点。

杨辉博士说：“现在，CRISPR基因治疗已经开始走向临床！我们实验室也在抓紧这方面的研究。我认为，未来10年，CRISPR基因治疗一定能攻克多种人类单基因遗传病，其中，与眼睛和耳朵相关的疾病治疗会走在最前沿。我也希望，未来有更多中国自主研发的基因治疗项目能够走向临床。”

4做科研，“交流”与“合作” 最重要

1985年出生的杨辉博士本科毕业于上海交通大学生命科学学院；2012年在中科院上海生化细胞所获博士学位；之后在Whitehead 研究所从事了一年多的博士后研究，2014年5月，正式成为中科院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员，并担任灵长类疾病模型研究组组长。

之所以选择“灵长类疾病模型”这一研究方向，杨辉博士告诉探索君：“非人灵长类是最接近人类的模式动物，对研究人类疾病，特别是脑疾病来说具有独有的优势。同时，非人灵长类疾病模型也是研究基因治疗及细胞治疗很好的工具。”

在采访接近尾声时，作为一名“85后”青年科学家，杨辉博士还与我们分享了他十年的科研心得，他认为：做科研，最重要的就是“交流”与“合作”。

他回忆道：“在我做科研最初的1-2年，主要是与文献之间的交流。这一时期，要读懂、理解别人的工作，才能有自己原创性的想法。之后的3-5年，主要是与实验结果及数据之间的交流，要善待阴性结果，排除假阳性，才能坚持到最后论文的发表。而在读博期间，最重要的则是与导师之间的交流，需要建立一条无障碍的快速交流通道。做博后期间，更多的是在于不同博后之间碰撞出思想的火花。而成为一名PI后，最重要的则又回归到和自己与学生之间的交流。”

关于合作，杨辉博士表示，当今时代，绝大部分论文都是通过多个作者通力合作完成的。他说：“成为一名PI后，我一直坚持着‘先朋友，后合作’的准则，这一点尤其适合青年PI。”

结语

“作为一名中国土生土长的博士，我认为，我们在各方面已经不逊色于世界一流学所的博士。从以前看到‘大牛’的盲目崇拜，到现在自身越发自信，这些转变让我们相信，中国科研达到世界一流甚至顶尖水平只是时间问题。我祝愿，每一位科研工作者，‘正在，并一直’享受自己的科研人生。”——采访中，杨辉博士的这几句话让小编很是印象深刻。(生物谷Bioon.com）

   
听说了一个重大新闻：

美国基因治疗公司Cancer Genetics采用RNAscope技术发现淋巴瘤PD-L1表达及其免疫应答的精细模式，该研究发表于第59届美国血液学会（ASH）年会。我们一起去看看吧！

   
Cancer Genetics advances understanding of immune response and measurement in lymphomas by combining PD-L1 expression analysis with RNA analysis

   
· 该研究发表于第59届美国血液学会（ASH）年会
· 该研究重点关注DLBCL（弥漫性大B细胞淋巴瘤）
· 该研究使用RNAscope技术获得精准医疗信息

     
转载自CGI公司网页新闻报道：

   
· RUTHERFORD, N.J., Dec. 11, 2017 (GLOBE NEWSWIRE) — Cancer Genetics, Inc. (Nasdaq:CGIX), a leader in enabling precision medicine for oncology through molecular markers and diagnostics, today announced results of a study demonstrating the potential value of being platform-agnostic and choosing the best diagnostic modality to evaluate an important molecular biomarker, PD-L1, in DLBCL (Diffuse Large B-Cell Lymphomas). The results (abstract 1477) were presented on Sunday, December 10, 2017 at the 59th ASH Annual Meeting in Atlanta.
新泽西州卢瑟福市2017年12月11日电（全球通社） – Cancer Genetics 公司（纳斯达克股票代码：CGIX）–分子诊断技术和肿瘤精准医疗的领导者-今天宣布了一项研究结果。该研究展示了诊断平台研究的潜在价值，筛选出了评估弥漫性大B细胞淋巴瘤中重要分子生物标志物PD-L1的最佳诊断方式。其研究结果（摘要1477）于2017年12月10日（星期日）发表于亚特兰大第59届ASH年会。

     
· The study compared performance of multiple antibody clones against PD-L1 and the current standard diagnostic modality, immunohistochemistry (IHC), to an in-situ hybridization (ISH), using RNAscope^®1 approach to determine the expression of PD-L1 in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cells, a particularly aggressive form of lymphoma.
该研究采用RNAscope^®1技术检测弥散性大B细胞淋巴瘤（高度恶性淋巴瘤）中的PD-L1，对比了PD-L1多克隆抗体免疫组化（IHC）标准诊断技术和原位杂交（ISH）技术。

   
· Although the two modalities demonstrated relative concordance related to the identification of PD-L1 expression, there were differences that indicated that RNA-ISH may be the superior approach. First, RNA-ISH appeared to be more sensitive, identifying cases of PD-L1 expression that were negative using IHC. Second, high PD-L1 expression identified by RNA-ISH, but not IHC, was highly correlated with non-germinal center B-cell subtype, gains at the PD-L1/9p24 locus (a predictor of PD-L1 inhibitor response) and demonstrated a trend toward worse overall survival. The study demonstrates that choice and integration of diagnostic modalities can provide key additional information to assist oncologists to more accurately select therapeutic options for their patients.
研究发现，两种方法的检测结果呈现出相对一致性，但存在一些差异，而这些差异恰巧表明使用RNAscope的RNA-ISH技术可能更好:

· 首先，RNA-ISH更敏感，能检测出IHC检测阴性结果病例中的PD-L1。

· 其次，RNA-ISH检测结果表明，PD-L1/9p24位点扩增和高表达的PD-L1（PD-L1抑制的预测因子）与非生发中心B细胞亚型以及整体生存率走低相关，而IHC检测没有体现该结果。

· 该研究表明，选择和整合正确的诊断方式，可以获得关键辅助信息，从而帮助肿瘤学家作出更加精准的治疗方案。

   
· “Precision oncology is all about better identifying the biomarkers in a patient’s tumor that both assist in diagnosis and drive a treatment plan tailored to the patient’s cancer with the objective of obtaining an optimal clinical outcome,” said Panna Sharma, President and CEO of Cancer Genetics. “This means that companies and laboratories in precision oncology should utilize the platform or platforms that generate the best validated information to drive treatment. This study demonstrates for a particular tumor type, DLBCL, that RNA-ISH generates superior information compared to IHC alone, which has been the standard for many years. We at Cancer Genetics would like to take this approach further to the benefit of the oncology community and the patients they treat.”
Cancer Genetics总裁兼首席执行官Panna Sharma说：“精准肿瘤学的目标是更精准地检测患者肿瘤细胞中的生物标志物，帮助诊断并制定个性化肿瘤治疗方案，以获得最佳的临床疗效”。“这意味着精准肿瘤学公司和实验室应该利用能够提供最佳验证信息的平台来推动治疗。这项研究表明，对于特定的肿瘤类型，如DLBCL，RNA-ISH技术优于使用多年的标准技术IHC，可提供更多有效信息。Cancer Genetics希望进一步使用这种诊断方法，为肿瘤学界和肿瘤患者谋利。

   
一大波Surprise来袭，摘要全文献给您

   
Poster and Oral Presentation Title (abst 1477): Precision in PD-L1 Assessment in Diffuse Large B Cell Lymphoma: Greater Biological Insight Using in Situ Hybridization approach

   
Imran Siddiqi, MD PhD1*, Venkata Thodima, PhD2*, Kishor Bhatia, PhD2*, Jane Houldsworth, PhD3 and Rita Shaknovich, MD, PhD4
1University of Southern California, Los Angeles
2Cancer Genetics Inc, Rutherford, NJ
3Pathology Department, The Mount Sinai Hospital, New York, NY
4Cancer Genetics, Inc., Rutherford, NJ

PD-L1 expression in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) has been associated with the activated B-cell (ABC) type, gains/ amplifications at the PD-L1/ 9p24 locus, and worse clinical outcome in the setting of conventional (R-CHOP) chemotherapy. Most of the prior studies have evaluated PD-L1 expression by immunohistochemistry (IHC), utilizing a variety of antibody clones and with various cut-offs for determining positivity. IHC methods for evaluating PD-L1 expression are inherently suboptimal due to the differing sensitivities/ specificities of the various clones and staining platforms and the lack of well-established interpretive criteria. Moreover, quantifying levels of PD-L1 expression by percent of positive cells and/or staining intensity are difficult and highly subjective. Alternative, highly sensitive and quantitative approaches for studying PD-L1 expression are available (e.g. gene expression profiling, flow cytometry), but these methods lack the ability to distinguish PD-L1 expression in lymphoma cells from those of the surrounding immune microenvironment.

RNA-based, in situ hybridization on formalin-fixed tissues is a sensitive, specific and more quantitative approach for determining levels of expression on morphologically preserved tissue. We analyzed 69 of DLBCL cases by RNAScope in situ hybridization (Advanced Cell Diagnostics) on an automated Leica platform. PD-L1 expression was quantitated in lymphoma cells using established scoring guidelines from 0 to 4 , where 0 corresponds to no RNA expression detected or only one hybridization signal and 4 corresponds to 10 or more signals per cell. From 69 cases of DLBCLs studied 45% had the score of 0, 17% score of 1, 23% score of 2, 6% score of 3 and 9% score of 4. Results were correlated with IHC (using a variety of commercial antibodies), cell of origin classification and gains/ losses at the 9p24 locus (PD-L1 locus).

We observed that PD-L1 expression quantified by RNAScope highly correlated with IHC (p<0.0001, Chi-square test) method. In the lower range of PD-L1 expression, RNAscope had higher sensitivity and dynamic range with 23 cases demonstrating no PD-L1 expression using IHC (score of 0) revealing low levels of amplification using RNAscope: with 15 cases at score 0, 7 cases at score 1 and 1 case at score 2. We also observed that high RNAScope scores categorized as high (3,4) were strongly correlated with non-GCB type and also with samples showing gain of 9p24 (p=0.0061 Chi-square test, p=0.0002, Chi-square test respectively). Interestingly, PD-L1 expression based protein detection using IHC correlated with EBV infection (p=0.008 Chi-square test), while RNAscope score demonstrated no significant correlation (p=0.6 Chi-square test). Comparison of IHC scores and RNAscope scores in EBV positive cases demonstrated that PD-L1 overexpression was not linked to 9p24 amplification, thus suggesting a different biological mechanism of PD-L1 overexpression in EBV-associated cases.

These findings shed additional light into potential mechanism of PD-L1 overexpression in DLBCLs and offer a complimentary and highly sensitive practical approach of assessing PD-L1 overexpressing tumors in FFPE tissue.

–转载自CGI公司新闻报道

更多详情，可查看以下网址

http://www.cancergenetics.com/cancer-genetics-advances-understanding-of-immune-response-and-measurement-in-lymphomas-by-combining-pd-l1-expression-analysis-with-rna-analysis/

（生物谷 bioon.com）

在杭州的一家医院里，从3月份开始，吴式琇一直在尝试用一种很有希望的新型基因编辑工具来治疗癌症患者。

这种名叫Crispr-Cas9的工具是由美国科学家设计的，从2012年媒体报道说这种工具可以用来编辑DNA之后就引发了全球关注。美国还不允许医生将这种工具用于人体试验，但对吴式琇和其他中国医生来说，情况不是这样。

在中国，由于这方面的监管障碍很少，吴式琇可以在患者身上试验这种新工具，这与全球同行业的做法大相径庭。吴式琇所在医院的审核委员会只用了一个下午就签字同意他进行试验，无需经过国家级监管机构的批准，在不良反应报告方面要求也较少。

吴式琇在杭州市肿瘤医院的团队从食道癌患者身上抽取血液，通过高铁列车将血液送到一间实验室，该实验室使用Crispr-Cas9删除一段干扰免疫系统抗癌能力的基因，从而改进抗病细胞。然后，吴式琇的团队将这些细胞注回到患者体内，希望重新编程的DNA能消灭癌症。

相比之下，中国以外的首例Crispr人体试验还没开始。美国宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)用了近两年时间来解决联邦机构等部门的要求，其中包括尽可能减小患者风险的种种安全检查。该校发言人说，虽然尚未获得最终联邦批准，但希望很快能通过审核。

吴式琇表示，本不该由中国第一个去做这件事，但这里的限制比较少。现年53岁的吴式琇是杭州肿瘤医院院长兼肿瘤医生。

在传统药物研发领域，不同国家的人体试验规则也可能存在差异。但中国对Crispr人体试验的尝试让一些西方科学家对这种全新的工具可能带来的意想不到的后果感到担心，例如可能对患者造成伤害，而一旦出现这种情况，对这一领域的打击将是整体性的。

接受《华尔街日报》调查的西方科学家并不认为美国应该放松这方面的要求，相反，许多人认为，从根本上改变人体DNA是一门尚未充分掌握的学科，国际上应该就道德问题达成一个共识。

约翰·霍普金斯大学伯曼生物伦理学研究所(Berman Institute of Bioethics at Johns Hopkins University)所长Jeffrey Kahn表示，如何确保每个人都在遵循同样的原则？鉴于Crispr还有不确定性，他认为国际上需要保持沟通。

中国无疑是第一个将Crispr用于人体试验的国家。美国国家医学图书馆(U.S. National Library of Medicine)数据库中记录了中国的九次试验。《华尔街日报》发现至少还有两次医院试验，其中一次始于2015年，较之前报道的时间早一年。《华尔街日报》发现至少有86名中国患者接受了基因编辑。

这些试验也符合中国的产业政策。中国正力争使国内一些产业走上国际舞台，基因编辑更是被列入中国2016年制定的五年规划目标。很多Crispr试验正是在此召唤后纷纷出现的。

宾夕法尼亚大学Crispr研究团队的首席科学家Carl June说，在将Crispr等西方国家开创的医疗技术加以应用方面，中国可能超过美国。他表示，美国处在一个危险的位置，可能失去在生物医药领域的领先位置。他认为，中美存在监管不对称，但Crispr科学非常前沿，很难在快速推进与确保患者安全之间找到理想的平衡点。

柯顿实验室的技术人员对癌症患者血液进行提取操作。图片来源：Qilai Shen for The Wall Street Journal

在欧洲，这类试验也未开始。Crispr Therapeutics AG去年12月宣布已向欧洲监管部门提交了启动一项临床试验的申请。该公司创始人包括一名与Crispr有关的科学家。一名发言人称，监管部门正在评估这项申请，该公司计划今年启动临床试验。

Crispr的诞生

CRISPR（规律成簇的间隔短回文重复序列）相当于细菌的免疫系统。2012年，由美国和奥地利科学家领导的一支团队发表了一篇论文，阐述了他们如何对一个特定的Crispr系统重新编程，使基因编辑成为可能。

这种新工具叫做Crispr-Cas9，以其使用的自然系统命名。这种工具就像分子剪刀，让科学家能够切割或修复DNA。2013年，美国科学家利用Crispr-Cas9在实验室里编辑了人类细胞的基因组。

与其他基因编辑方法相比，这项技术更容易使用，成本也更低。实验室数据表明，这项技术可以纠正一些导致不治之症的小故障。Crispr刺激了大量投资，詹妮弗·洛佩茨(Jennifer Lopez)计划出品的一部科幻电视惊悚片也以此为题材。

但改写基因会遭遇各种科学和伦理难题。其一，Crispr可能给人类带来意想不到的不可逆转的改变，而且可能要过很多年才会显现出来。

斯坦福大学(Stanford University)最新发表的论文指出，许多人可能对Cas9蛋白质具有先天免疫力，一些Crispr疗法可能不起作用，甚至引发危险的免疫反应。

吴式琇也同意这种技术可能存在风险，认为Crispr是一把双刃剑。他说，别人看到潜在的不良后果，而他们看到的是潜在的疗效。他说，速度是关键，他的患者已是生死一线，如果不试一下，永远都不会知道答案。

中国的试验还未有任何结果发表。虽然吴式琇和其他医生表示有些病人病情好转，但在已知的86名病患中，至少有15人死亡，参与试验的医生说，这些病人是死于自身疾病。

起初，美国似乎走在前头。宾夕法尼亚大学获得资助的Crispr试验在2016年成为这一领域首批进入公众视野的试验之一，该试验以患有多发性骨髓瘤、肉瘤和黑色素瘤的病人为目标。

2016年晚些时候，有媒体报道说一家中国医院已开始进行全球首例Crispr试验。但事实上并非首例。据相关试验负责人刘波说，位于合肥的解放军第105医院早在2015年就开始在病人身上试验Crispr。

据刘波和相关公司称，中国初创公司安徽柯顿生物科技有限公司(Anhui Kedgene Biotechnology Co.)曾与这家部队医院接触，提出在柯顿实验室里应用Crispr，具体做法是由医生招募参与者，提取参与者身上的血液，然后将经过编辑的细胞重新注入病人体内。

周敏(Mandy Zhou)于2015年与他人联合创办了柯顿生物科技并培训医学院学生使用Crispr，她说，医生们不懂基因编辑，所以大家必须合作。

周敏说，在部队所属医院进行的早期注射试验中，有的试验对象的肿瘤缩小。她在2016年与合肥的安徽省立医院进行了另一次试验。45岁的病人张建民也参与了这次实验，他的医生王勇说，张建民等患者的病情有缓解迹象。而之前多年的化疗并没有阻止张建民的鼻咽癌病情恶化。而参与试验的王勇医生说，在接受Crispr注射几个月后，张建民的鼻肿瘤缩小了。

在9月份接受采访时，张建民在病床上说，如果自己的病情持续好转，就应该相信科学。王勇说，张建民目前情况良好。

两场试验

周敏去年联系了吴式琇，提议与柯顿生物科技在位于250英里（400公里）以外的一间实验室里再进行一次基因编辑试验。

吴式琇说自己很想做这次试验。他只需要从自己所在医院的伦理委员会获得批准就可以了。伦理委员会类似于美国的人体试验委员会，负责对相关提议进行审核并评估风险。

在美国，研究人员必须首先获得美国食品药品管理局(Food and Drug Administration， 简称FDA)批准，才能进行人体试验。中国卫生部负责管理医药行业，授权各医院的伦理委员会对人体试验研究进行审核。卫生部未回应置评请求。

对吴式琇的试验申请进行评估的委员会由其所在医院任命，委员会由九人组成，包括来自该院的几位医生、一位律师和曾经的癌症患者郑晓敏。委员会委员说，到场的七位委员翻阅了吴医生提交的100页左右的报告，并观看了PPT演示。

提前一天收到报告的郑晓敏说，她很难把报告读完，因为不理解其中的学术细节。但她也确实询问了副作用，回答是副作用不大。

放射科医生邓清华也是委员会成员，他说自己投了赞成票，因为被剔除的基因在之前成功的癌症治疗案例中就被定位过，意味着风险比较小。这项申请只用了一个下午就获得一致通过。

而另一边，宾夕法尼亚大学的June博士正在经历一个更加严格的流程。

宾夕法尼亚大学Crispr研究团队负责人Carl June。 图片来源：Penn Medicine

为获得所在医院评估委员会和FDA的批准，June首先尝试获得美国国家卫生研究院(National Institutes of Health， 简称NIH)顾问委员会的评估。由于公众对新基因技术存在怀疑，NIH在40年前设立了这个顾问委员会。

根据委员会成员的描述和会议记录，在2016年6月的一次会议上，NIH顾问委员会要求宾夕法尼亚大学研究团队加强对患者的提醒，向患者说明这是试验性疗法，不良反应可能无法逆转。

斯坦福大学生物伦理学家Mildred Cho是该委员会成员之一，她要求宾夕法尼亚大学的团队将试验描述为“基因转移”而非“基因治疗”，她认为后一种说法隐含着有效疗法的意思，而没有指出这是一项试验。研究人员遵守了这一要求。

芝加哥大学神学院(University of Chicago Divinity School)院长兼该委员会生物伦理学家Laurie Zoloth表示，要确保每个人都知道这是一项试验，而不是治疗手段；对于癌症晚期患者来说，这种干预手段可能特别折磨人，而且试验可能失败，后果可能很可怕。

等到进行NIH听证会的阶段，June所在的研究室已经做了各种测试，观察Crispr在减少细胞方面是否会出现意外。他说，FDA想了解更多情况。FDA没有就相关试验过程置评。

另一方面，吴式琇表示，他没有时间做这样的测试，因为他的末期患者急需治疗。

NIH顾问委员会后来批准了宾夕法尼亚大学研究团队的计划，之后研究人员又花了一年时间与FDA讨论，向后者提供信息并答疑解惑。宾夕法尼亚大学发言人说，伦理审查已经于2017年底完成，目前正等待FDA最终批准。June说，他预计最早本月获批。

但即使在试验开始后，宾夕法尼亚大学也将面临与吴式琇不同的标准。在招募病人时，宾夕法尼亚大学的研究人员必须使用由FDA和医院机构评估委员会检查过的同意书。斯坦福大学的Cho称，涉及生物医学研究中病人受到伤害的案例引发了一连串事件，于是有了目前的监管系统。

吴式琇的同意书简略地提到了基因工程。他说，他告诉病人，其试验目的是修改病人的免疫系统，但没有详细说明他使用的是试验性的工具。他说，他对参与者的解释因他们的教育程度而不同。

柯顿生物科技的周敏称，中国的患者会签同意书，但基本上是听医生的。

宾夕法尼亚大学还必须报告死亡案例。FDA发言人表示，调查人员必须立即将死亡等严重不良事件通报给试验的举办方，无论死亡是否与试验相关。然后举办方必须通知FDA。

工作人员将杭州市肿瘤医院一位病人的血样采集封装好，送往位于合肥的柯顿生物科技实验室。在柯顿，技术人员对血液中免疫细胞的基因进行编辑。随后，医院将含有“改良细胞”的血液注回到患者体内。图片来源：Qilai Shen for The Wall Street Journal

根据吴式琇和其他参与试验的医生提供的情况，柯顿生物科技的三项试验已知死亡15起，有七人是吴式琇的病人。吴式琇表示，其试验中的病人死亡是其所患疾病所致，与Crispr无关，因此不需要向伦理委员会报告。

中国卫生部要求研究人员向相关伦理委员会报告不良事件。吴式琇称，与试验无关的死亡事件不被认为是不良事件。南京大学医学院附属鼓楼医院Crispr试验带头人魏嘉说，试验中任何死亡事件都被认为是不良事件。Wei与柯顿没有关系。

June称，宾夕法尼亚大学的研究将测试Crispr是否安全，而不是测试能否治愈患者。研究人员计划在一位患者身上测试Crispr，等待一个月确保没有发生不良反应，然后在另外两位患者身上测试。

吴式琇说，他认为挽救患者生命是最重要的。他最初在三位患者身上测试了Crispr，现在已经修改了10多位患者的基因。他称，他计划在肺癌和胰腺癌患者身上进行更多测试。

并非所有中国Crispr测试都能轻松获得批准。在似乎是全球首例Crispr人体试验中担任首席调查员的刘波说，他们医院的伦理委员会花了几个月的时间进行评估，要求他提交补充材料，然后才批准了他的试验。

预计未来18个月将有更多美国Crispr测试启动，与Crispr相关的科学家创办的上市公司将牵头进行这些测试。

芝加哥大学的Zoloth说，她希望各国制定Crispr的国际化标准、共享试验结果和伦理准则。她说，科学证明究竟意味着什么，保护一个人又意味着什么，这些问题大家需要集体讨论。(生物谷Bioon.com）