基因新闻 第212页

2016年12月10日/生物谷BIOON/—CRISPR/Cas9基因组编辑正快速地引发生物医学研究变革，但是这种新技术迄今为止并不是非常精确的。这种技术能够在基因组中无意地产生过多的或者不想要的变化，产生脱靶突变，从而限制了它在治疗应用中的安全性和疗效。

如今，在一项新的研究中，来自美国马萨诸塞大学医学院和加拿大多伦多大学的研究人员发现首批已知的CRISPR/Cas9活性“关闭开关”，从而为CRISPR/Cas9编辑提供更好的控制。相关研究结果于2016年12月8日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Naturally Occurring Off-Switches for CRISPR-Cas9”。

马萨诸塞大学医学院RNA治疗研究所教授Erik J. Sontheimer博士、多伦多大学分子遗传学教授Alan Davidson博士和多伦多大学生物化学助理教授Karen Maxwell博士鉴定出三种自然产生的抑制Cas9核酸酶的蛋白。这些被称作抗CRISPR的蛋白具有阻断Cas9切割DNA的能力。

Sontheimer博士说，“CRISPR/Cas9是一种好东西，这是因为它会引入特异性的染色体断裂从而能够被用来进行基因组编辑，但是鉴于染色体也会是有害的，好东西过多或者让它持续太长时间有可能会适得其反。当前，一旦Cas9被转运到细胞中，就缺乏一种关闭它的可靠方法。如果在执行正确的编辑后，你能够启动关闭开关，那么这种问题就会被解除。我们报道首批已知的Cas9活性的天然抑制剂。”

Davidson博士说，“CRISPR是非常强大的，但是必须能够关闭它。这是对现有工具箱的一次非常重要的补充，这应当给予科学家们更多的信心进行基因编辑。”

CRISPR/Cas9系统是一种被细菌用来自我抵抗外源遗传物质的适应性免疫系统。它由两个组分组成：一种高效地切割DNA的分子手术刀（Cas9）和一种引导Cas9在精确的位点进行切割的向导RNA复合体（gRNA）。这些gRNA是由含有过去的病毒感染遗留在宿主基因组中的序列片段的CRISPR阵列产生的。通过让Cas9靶向和灭活这些病毒，CRISPR/Cas9系统为细菌细胞提供一种适应性免疫防御。

科学家们能够利用人工gRNA对CRISPR/Cas9系统进行重编程来对哺乳动物基因中的序列进行切割，并且能够让新的遗传信息片段准确地插入到细胞中。作为一种简单而又高效地编辑基因组的方法，CRISPR/Cas9通过让用于研究的细胞系中的基因失活或编辑更加容易而正在改变着生物医学研究。它也让构建能够被用来研究人类疾病的动物疾病模型简单化。过去需要几个月或几年完成的研究工作如今能够在几周内完成。

尽管CRISPR/Cas9系统非常强大，但是它并不是精确的。用来将Cas9引导到基因组中合适位置的gRNA有时候也会引导Cas9到其他类似的但不是相同的序列上。这些错配的位点有时能够被切割，从而导致不想要的损伤。

在很多CRISPR/Cas9应用—包括用于治疗开发—中，存在正被靶向编辑的特定细胞类型、组织或器官，这是因为疾病是在那里自我体现出来或者治疗益处能够在那里实现。

Sontheimer博士说，“在这些情形中，CRISPR/Cas9可能进入目的细胞，但是它也可能进入其他的辅助细胞、组织或器官。Cas9活性在这些辅助细胞、组织或器官中最好是无用的，不然会存在安全风险。但是如果你能够构建出一种让Cas9在除靶组织之外的其他地方保持在非活性状态的关闭开关，那么这种组织特异性将会得到改善。”

Sontheimer博士说，这项新研究不仅鉴定出这种“关闭开关”，而且它还证实Cas9抑制剂自然地存在，而且能够被鉴定出和使用。

他说，“存在很多种不同细菌产生的不同类型的Cas9，而且这些不同的Cas9在基因组编辑中存在着不同的有用性质。已有几种存在于工具箱中的Cas9，而且还会有更多的Cas9出现。我们如今证实这些抑制剂存在自然世界中，而且我们已提供一种可能能够发现它们的策略。”（生物谷 Bioon.com）

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Naturally Occurring Off-Switches for CRISPR-Cas9

April Pawluk, Nadia Amrani, Yan Zhang, Bianca Garcia, Yurima Hidalgo-Reyes, Jooyoung Lee, Alireza Edraki, Megha Shah, Erik J. Sontheimer, Karen L. Maxwell, Alan R. Davidson

doi:10.1016/j.cell.2016.11.017

图片来源：medicalxpress.com

2016年7月16日 讯 /生物谷BIOON/ –近日，刊登在国际杂志Nature上的一项研究论文中，来自MIT的研究人员通过研究发现了一些特殊路径，特定的微生物可以借助这些路径来环游世界，文章中研究者揭示了他们如何从居住在斐济（太平洋岛国）的村民中收集微生物样本来研究微生物转移的天然特性。

人类机体从里到外都布满着细菌，但这些细菌如何在人群间互相转移至今研究者并不清楚，文章中研究人员对居住在斐济偏远村庄的人们机体中的微生物群落进行了研究，研究人员从这些村民机体多个部分获取了微生物的样本，由于这些个体居住地较为偏远而且居住相对固定，因此其并不太可能像其它居住在流动地区的人们一样容易获得或接受新的微生物群落的定植。

研究者收集了来自5个不同村庄的172名个体的粪便、唾液及手拭子样本；同时也从来自北美的81名个体收集到了相应样本，研究者的目的就是观察如果他们利用对微生物的分析结果来绘制出了一种社会图谱，是否就可以揭示该地区的微生物扩散情况，作为部分研究，研究人员对个体的微生物细胞进行测序来观察微生物机体的系列基因，而这对于有效鉴别微生物非常关键。

研究者表示，他们发现，简单且每日的活动或许对人类微生物组中存在的微生物基因的转移有一定的影响，甚至在不同微生物种间也是如此；举个例子，研究者发现，居住在斐济的人群相比于居住在北美的人群而言，肠道中含有较多的微生物群落，其中就包括了一种可以帮助机体消化淀粉的特殊细菌；同时研究者在不同村庄人群的肠道微生物水平上也发现了细微的差别，这或许为深入研究特殊微生物群落如何转移以及如何改变微生物组提供了很好的线索。

最后研究者表示，本文研究为很好地解释为何不同群体的人群更易于或者不太易于患某些疾病提供了很好的研究线索和思路，比如消化问题、过敏甚至哮喘等问题。（基因宝jiyinbao.com）

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12月5日，Nature Biotechnology杂志在线发表了题为“Multiplex gene editing by CRISPR–Cpf1 using a single crRNA array”的研究成果。CRISPR先驱张锋以及Wageningen大学的John van der Oost是这篇论文的共同通讯作者。

突破：可实现同时编辑多达4个基因

近几年，CIRSPR技术飞速发展，除了“元老”CIRSPR/Cas9系统，科学家们还找到了一些新“选手”。2015年9月，张锋研究组在Cell杂志上发表的一篇论文中首次提出了新型基因编辑系统CRISPR/Cpf1。Broad研究所Eric Lander教授称，该研究证明了Cpf1在编辑人类基因组中非凡强大的功能。

在这项新研究中，科学家们发现，CRISPR/Cpf1系统能够克服Cas9靶向多个基因位点的限制。研究表明，Cpf1加工自身CRISPR RNA （crRNA）的能力可用于简化多重基因组编辑。使用单个定制的CRISPR阵列（array），研究人员实现了在哺乳动物细胞中同时编辑多达4个基因，在小鼠大脑中同时编辑3个基因。

4月：2篇Nature、1篇Cell

自CRISPR/Cpf1系统被提出以来，来自全球各国的科学家纷纷对其展开进一步的研究。今年4月，CRISPR/Cpf1系统迎来了一个发文小高峰。

4月20日，发表在Nature杂志上题为“The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA”的研究中，哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授及其团队首次揭示了CRISPR-Cpf1识别crRNA的复合物结构。

同日发表在Nature上题为“The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA”的研究证明了Cpf1在定向基因编辑中能执行RNA加工和DNA切割两个活动，这可能打开了对特定序列基因组编辑和沉默的新方向。CRISPR先驱Emmanuelle Charpentier是这一研究的通讯作者。

4月21日，发表在Cell杂志上题为“Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA”的研究揭示出了Cpf1/向导RNA/靶DNA复合物的晶体结构。张锋及东京大学Osamu Nureki教授是这一研究的共同通讯作者。

6月：3篇Nature Biotechnology

另一个发文高峰是在6月。据不完全统计，Nature Biotechnology杂志当月连发了3篇与CRISPR/Cpf1系统相关的成果。

题为“Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1”和题为“Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins”的两篇论文证实了Cpf1作为一种不会引发意外突变的精确基因组编辑工具具有的优势。韩国基础科学研究所的Jin-Soo Kim是这两项研究的通讯作者。

题为“Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells”的研究解析了新一代的CRISPR-Cas Cpf1核酸酶在人类细胞中的全基因组特异性。麻省总医院/哈佛医学院的J Keith Joung和Benjamin P Kleinstiver是这一研究的共同通讯作者。

展望：新系统层出不穷，“各领风骚”

在科学家们的共同努力下，基因编辑工具家族可谓是越来越壮大。一方面，研究人员在CRISPR/ Cas9系统基础上进行改造，实现了多种新功能，包括只“剪”单个碱基、任意编辑非分裂细胞等。

另一方面，科学家们也开发出了一些新的系统，除了上文中提到的CRISPR/Cpf1，还包括张锋研究组提出的靶向RNA的CRISPR/C2c2系统、南京大学科学家提出的结构引导的DNA编辑工具——SGN等。

CRISPR先驱Jennifer Doudna在接受Cell杂志采访时表示，CRISPR的多功能性为能够改善人类生活的生物学和医学研究带来了新的、更广泛的可能。希望这一被寄予厚望的“魔剪”真正能够改变人类疾病的治疗，成为战胜病魔的有效工具。（生物谷Bioon.com)

昨天，基因治疗公司Voyager Therapeutics宣布正在进行的针对晚期帕金森病患者的1b期临床试验，在6个月和12个月随访中获得阳性结果。来自该试验的第1组和第2组的中期数据表明，在研新药VY-AADC01良好耐受的；通过精确的MRI引导递送的、剂量递增的该治疗手段增大了壳核（putamen）的覆盖程度、增加了AADC酶活性并且增强了对左旋多巴的反应，最终在临床上有意义地改善了患者运动功能的各种测量参数。这在较高剂量下的第2组中尤其明显。上述这些良好效应在一些患者长达12个月的随访期间得到了维持性改善。

帕金森病是一种慢性神经退行性疾病，在美国约有70万患者，全世界病人约有700万至1000万例。据估计，高达15％的帕金森病患者群体（在美国该数量约为100万）具有左旋多巴难治或无良好控制的运动波动。虽然在大多数患者中帕金森病的根本原因是未知的，但该疾病的运动症状来自产生神经递质多巴胺的中脑神经元的损失。大脑这一特定区域中多巴胺水平的下降导致与帕金森病相关的运动症状，包括震颤、运动缓慢或运动丧失、僵硬和姿势不稳定。该疾病晚期阶段的运动症状包括摔倒、步态僵直、言语和吞咽困难，患者通常需要护理人员的日常协助。

▲帕金森病的运动症状源于缺少神经递质多巴胺（图片来源：MedicalTerms.info）

目前没有有效减缓或逆转帕金森病进展的疗法。左旋多巴仍然是护理治疗的标准，它对症状控制的有益效果已经在40多年前被发现。患者通常在疾病的早期阶段使用口服型左旋多巴可取得良好控制，但随着疾病进展而变得对该治疗方案的反应程度较低。

帕金森病的退行性运动症状主要是由于黑质中多巴胺神经元的死亡。黑质是将左旋多巴转化为多巴胺的中脑区域的一部分，这一转化过程是由芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC）催化的单一生化步骤。黑质中的神经元将多巴胺释放到多巴胺受体所在的壳核（putamen）中。在晚期帕金森病中，黑质中的神经元退化并且AADC酶在壳核中显着减少，这便限制了大脑将左旋多巴转化为多巴胺的能力。

VY-AADC01是Voyager的创新型基因治疗载体，主要含有编码AADC酶的基因。它包括了腺相关病毒-2衣壳和巨细胞病毒启动子来驱动AADC基因表达，旨在将AADC基因直接递送到多巴胺受体所处的壳核中，于是绕过黑质神经元，并使壳核的神经元表达AADC酶以有效将左旋多巴转化为多巴胺。因此，VY-AADC01的方法原理具有持续增强左旋多巴向多巴胺的转化潜力，并且可在单次施用后提供运动症状临床意义上的改善。

▲Voyager致力于开发CNS疾病的创新型基因疗法（图片来源：Voyager Therapeutics）

这个1b期、开放标签试验招募了20多名患有晚期帕金森病和致残运动波动的患者，施用了VY-AADC01单次治疗。该试验的主要目的是评估在大脑壳核区域中递升剂量VY-AADC01的安全性和外科覆盖程度，所述壳核区域是帕金森病中与运动功能相关的脑区域。试验的次要目的包括使用[18 F]氟多巴（或18 F-DOPA）标记的正电子发射断层扫描（PET）测量来评估壳核中AADC的表达和活性。此外，通过左旋多巴的受控静脉内输注，可以测量左旋多巴和相关药物的每日需要来确定针对左旋多巴的运动反应变化。其他运动功能评估的次要目标包括统一帕金森病评定量表（UPDRS）和患者完成（Hauser）的日志测量。UPDRS是帕金森病的标准临床评定量表。

▲Voyager的临床开发副总裁Bernard Ravina博士（图片来源：Voyager Therapeutics）

“在第2组中随访12个月时，VY-AADC01治疗促进了无药UPDRS-III指标上14点或44％幅度的改善，用药UPDRS-III指标上有9点或55％的改善，“Voyager Therapeutics的临床开发副总裁Bernard Ravina博士说道 “非常重要的是，这些运动功能的改善在第2组维持了12个月，这是引人注目的发现并且与 VY-AADC01的作用机制相吻合。该试验的剂量递增部分将继续，我们计划在2017年初完成第3组（更高剂量组）入组，报告该队列的6个月数据，以及2017年中期将报告第1组和第2组的长期数据。”（生物谷Bioon.com)

参考资料：
[1] Voyager Therapeutics (VYGR) Soars as Parkinson’s Drug Shines in Early-Stage Trial
[2] Voyager Therapeutics官方网站

2016年7月15日讯 /生物谷BIOON/ –最近来自西南医学中心的科学家们在大脑中找到了一个可能导致抑郁的蛋白，他们利用基因疗法对这个新靶点进行了干预，发现小鼠的抑郁症行为得到了改善。该研究将促进抑郁症新治疗方法的开发。

研究人员发现一类叫做HCN的通道蛋白减少会抑制小鼠的抑郁症类似行为。如果该结果可以复制到人类，将为几百万对现有治疗方法无应答的抑郁症患者提供新疗法。

该研究结果发表在国际学术期刊Molecular Psychiatry上。

目前绝大多数抗抑郁症药物都会通过增加单胺类神经递质如5-羟色胺、多巴胺和去甲肾上腺素来影响病人心情和情绪，但是事实上这些药物对许多病人并不有效，这表明还有其他导致抑郁症的机制并没有被发现，而这些未发现机制将有可能为新治疗方法开发提供靶点。

在这项研究中，研究人员将一种能够关闭HCN通道的基因添加到工程改造的病毒中，随后通过注射的方法将病毒注射到小鼠的海马神经元。当HCN通道的功能被关闭，小鼠的行为就像接受了抗抑郁症药物的治疗一样。而重新增强HCN通道蛋白的功能则会抵消病毒的抗抑郁效果。

为了衡量小鼠的抑郁症类似行为，科学家们检测了小鼠在完全放弃之前试图逃脱一个环境所需的时间，这种检测方法常用于制药行业进行抗抑郁小分子的筛选，目前市场上的药物就利用了这种筛选方法。

研究人员表示，这项工作发现了一个全新的抑郁症治疗靶点，未来他们打算利用这种基因治疗方法对病人进行治疗。（基因宝jiyinbao.com）

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doi:10.1038/mp.2016.99 

HCN-channel dendritic targeting requires bipartite interaction with TRIP8b and regulates antidepressant-like behavioral effects

Y Han, R J Heuermann, K A Lyman, D Fisher, Q-A Ismail and D M Chetkovich

Major depressive disorder (MDD) is a prevalent psychiatric condition with limited therapeutic options beyond monoaminergic therapies. Although effective in some individuals, many patients fail to respond adequately to existing treatments, and new pharmacologic targets are needed. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels regulate excitability in neurons, and blocking HCN channel function has been proposed as a novel antidepressant strategy. However, systemic blockade of HCN channels produces cardiac effects that limit this approach. Knockout (KO) of the brain-specific HCN-channel auxiliary subunit tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) also produces antidepressant-like behavioral effects and suggests that inhibiting TRIP8b function could produce antidepressant-like effects without affecting the heart. We examined the structural basis of TRIP8b-mediated HCN-channel trafficking and its relationship with antidepressant-like behavior using a viral rescue approach in TRIP8b KO mice. We found that restoring TRIP8b to the hippocampus was sufficient to reverse the impaired HCN-channel trafficking and antidepressant-like behavioral effects caused by TRIP8b KO. Moreover, we found that hippocampal expression of a mutated version of TRIP8b further impaired HCN-channel trafficking and increased the antidepressant-like behavioral phenotype of TRIP8b KO mice. Thus, modulating the TRIP8b–HCN interaction bidirectionally influences channel trafficking and antidepressant-like behavior. Overall, our work suggests that small-molecule inhibitors of the interaction between TRIP8b and HCN should produce antidepressant-like behaviors and could represent a new paradigm for the treatment of MDD.

2016年7月14日/生物谷BIOON/–抗生素的出现，拯救了无数生命。但是细菌对于抗生素产生的耐药性问题也逐年加重，新药研发的速度远跟不上细菌耐药出现的速度。

多年来，由于抗生素的滥用，多种耐药性基因开始在全球蔓延。一旦大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和其它类似的肠道栖息生物产生耐药性，那么对革兰氏阴性菌有很强杀菌作用的多粘菌素（polymyxin）和具有广谱抗菌作用的碳青霉烯类抗生素就是我们仅剩的为数不多的选择。但是令人讽刺的是，在包括中国在内的一些国家，多粘菌素等抗生素常被用作动物饲料的添加剂，因为它能够促使动物更快地长肉，结果导致耐药性细菌甚至超级耐药细菌接连出现。

2007年9月，我国深圳市第二人民医院验科徐小平副主任成功发现了两个与细菌耐药相关的新型OXA基因，这两个基因均属世界首次发现。世界基因库已正式把这两个基因命名为 OXA-116和OXA-117。这一重大发现为进一步对耐药菌株的监测、指导临床合理用药、减少耐药菌产生和传播具有着极其重大的意义。

2010年9月发表在Lancet Infectious Diseases期刊上的一项研究指出一种新型的耐药性细菌对几乎所有抗生素都具有耐药性，死亡率很高。这种细菌携带一种抗生素耐药性基因。鉴于这种耐药性细菌感染最早出现在印度、巴基斯坦等南亚国家，因此，这种耐药性基因被命名为NDM-1，又名新德里金属-β-内酰胺酶1。携带NDM-1基因的细菌大多数为大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。除了替加环素和粘菌素之外，这种耐药性细菌对其它抗生素都具有耐药性，如对碳青霉烯类抗生素也产生耐药性，而这种碳青霉烯类抗生素通常被认为是紧急治疗耐药性病症的最后方法。 鉴于NDM-1基因存在耐药性细菌的质粒中，很容易从一种细菌扩散到另一种细菌中，这令科学家们感到十分忧虑。

2015年11月18日发表在Lancet Infectious Diseases期刊上的一项研究中，中国研究人员在动物和人身体细菌样本中均发现一种新耐药性基因MCR-1，再一次给抗生素滥用问题敲响警钟。 在这项研究中，研究人员以中国不同地方的农贸市场和屠宰场中采集到的大肠杆菌和克雷伯菌为研究样本，首次发现MCR-1基因的存在。而且，携带有该基因的细菌对多粘菌素表现出抗性，这种抗性还能够快速转移至其他不同菌种。

研究人员发现问题的关键在于，MCR-1基因以质粒为载体存在于细菌中，能够以基因水平转移方式在不同菌株间进行遗传物质的交换。这种转移模式打破亲缘关系的界限，能够在不同细菌之间传播，且速度快。

而最新的一项研究中，一个意大利研究团队发现一种新出现的抗生素耐药性基因变体。这种新的基因变体被称作MCR-1.2，对用来抵抗多药耐药性革兰氏阴性病原菌的多粘菌素（作为最后一道防线）产生耐药性。相关研究结果于2016年7月11日在线发表在Antimicrobial Agents and Chemotherapy期刊上，论文标题为“MCR-1.2: a new MCR variant encoded by a transferable plasmid from a colistin-resistant KPC carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae of sequence type 512”。

论文通信作者、意大利佛罗伦萨Careggi大学医院临床微生物学与病毒学科室主任Gian Maria Rossolini博士说，“对未来的抗菌疗法开发而言，这是特别令人忧虑的。”她补充道，更令人担忧的是，这种新的耐药性机制是在病原菌肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的一种多药耐药性菌株中发现的。这种细菌是从一名住院的白血病儿童的直肠拭子（rectal swab）样品中分离出来的。

Rossolini说，研究人员发现这种细菌对一种不同寻常的抗生素组合产生耐药性。在注意到一种奇怪的耐药性特征后，论文第一作者Vincenzo Di Pilato博士重新分析了这种细菌的基因组数据，从中发现了这种新的基因，它是多粘菌素耐药性基因MCR-1的变体。

与MCR-1一样，MCR-1.2也是由质粒携带的，因而也很容易从一个细菌转移到另一个细菌，甚至从一种细菌物种转移到另一种细菌物种。（生物谷 Bioon.com）

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参考资料：

【1】深圳医生发现两个新型耐药基因

【2】“超级细菌”的耐药性基因可遗传

【3】Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study
Lancet Infectious Diseases, doi:10.1016/S1473-3099(10)70143-2

【4】Dissemination of the mcr-1 colistin resistance gene
Lancet Infectious Diseases, doi:10.1016/S1473-3099(15)00533-2

【5】MCR-1.2: a new MCR variant encoded by a transferable plasmid from a colistin-resistant KPC carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae of sequence type 512
doi:10.1128/AAC.01075-16

博德研究所实验室主任、华裔生物学家张锋

围绕着基因编辑技术CRISPR-Cas9专利权、涉及数十亿美元的专利之争又有了新进展。美国时间12月6日，在位于弗吉尼亚州亚历山大市的美国专利商标局（PTO）总部，在由三位法官组成的专利审判和上诉委员会面前，争夺专利的两方——加州大学伯克利分校和麻省理工学院-哈佛大学博德研究所再次交锋。现场，就CRISPR-Cas9技术在真核细胞上成功应用这一重要节点，法官对加州大学伯克利分校频频发难。

在该起专利案做出最终裁决之前，这是双方第一次也是仅有的和法官对话的机会。听证会的核心议题在几个月前就已经敲定，围绕着CRISPR-Cas9技术在真核细胞上实现基因编辑而展开。双边律师各有20分钟时间阐述观点。听证会没有达成任何决定。

据外媒报道，在听证会开始前一小时，前来旁听的观众已经排起长队。其中不乏生物技术领域的投资商、专利律师、生物企业的代表人、记者。

这场专利官司因为涉及数十亿美元，争夺的对象又恰是当今生命科学领域最为明星的“基因魔剪”的CRISPR-Cas9，而广受关注。官司的核心人物是加州大学伯克利分校生物学家詹妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）和博德研究所实验室主任、华裔生物学家张锋。

基因编辑技术可以实现对DNA片段的敲除、加入等，在可预计的未来，将在治疗疑难杂症上大有市场。目前已有数个关于CRISPR的生物技术公司成立，涉及数亿元的风险投资。其中就包括张锋创立的、已经公开募股筹得9440万美元的公司Editas Medicine和杜德娜创立的、获得诺华两轮共计8500万美元投资的公司Intellia Therapeutics。

据科技网站The Verge报道，从听证会现场的情况来看，加州大学伯克利分校不占优势。法官们对加州大学伯克利分校的观点——“CRISPR技术可拓展在真核细胞上是显而易见”存疑。

现场，法官Deborah Katz问道：“如果真是这么显而易见，为什么杜德娜不自己做？”加州大学伯克利分校的代理律师Todd Walters表示，这是因为在2012年发表第一篇关于CRISPR论文后，在短时间内，詹妮弗·杜德娜的实验室还没有准备好在真核细胞里进行CRISPR实验。此外，Katz还问道：“有公开声明过（宣布CRISPR在真核细胞里能有效工作）吗？” Walters没有直接回答，他指出的是杜德娜曾表示在真核细胞中使用CRISPR“现在是一个非常现实的可能”。继而，另一位法官Sally Lane提醒，杜德娜尝试过在人类细胞中使用CRISPR但多次失败。

据《自然》杂志报道，相比之下，法官对博德研究所代理律师Steven Trybus的盘问要宽松得多。听证会期间，Trybus援引了当时杜德娜接受采访时所说的话——正在艰难地将CRISPR应用在真核细胞上。

《科学》杂志援引各方观点表示，一些人士认为博德研究所赢得了当天的听证会，但亚利桑那州立大学研究专利法的教授Robert Cook-Deegan觉得不应该对法官的提问和回应过度解读。“他们（指法官）也许只是通过提问来看看律师的论据站不站得住脚。”Cook-Deegan说。

据有关人士推测，专利裁决可能将在2017年1月底、2月初时做出。目前为止尚且无法预测会有什么样的裁决，也许保持现有的专利归属（也就说博德研究所享有CRISPR在真核细胞上的专利权），或者宣布博德研究所的专利无效，并将专利归于加州大学伯克利分校，但也不排除博德研究所和加州大学伯克利分校平分专利的可能。

加州大学伯克利分校生物学家詹妮弗·杜德娜

CRISPR专利之争时间线回顾：

据张锋此前接受美国媒体STAT的访谈中提到，2011年2月，他在一场研究报告中第一次接触到CRISPR，随即和当时的学生丛乐决定跳过原核生物，直接在老鼠和人类的细胞中研究CRISPR系统的有效性，并在2012年春完成基础工作，但为有更重大的进展突破，暂时没有发表。

直到2012年6月，杜德娜发表利用原核生物的CRISPR系统在体外编辑试管中的DNA的论文，张锋实验室争分夺秒，在2012年10月向《科学》投稿，并在2013年1月3日在线发表，率先在人类细胞上实现CRISPR基因编辑。

专利之争也在那时拉开帷幕。科学专利一般在论文发表前夕开始申请。2012年5月25日，加州大学伯克利分校向美国专利与商标局提交了与CRISPR相关的专利申请。同年12月12日，张锋与博德研究所也向美国专利与商标局提交了申请，申请对象是在哺乳动物细胞的基因组上进行CRISPR-Cas9基因编辑这一方法。

尽管在申请时间上，张锋比杜德娜晚了近7个月，但由于专利申请周期长，杜德娜没有因此得势。反而，张锋通过缴纳70美元的快速审核通道，凭借能证明自己比杜德娜更早做出实验的实验记录本，在2014年4月15日，获得了美国专利与商标局关于CRISPR的第一个专利授权。专利权限包括在真核细胞或者任何细胞有细胞核的物种中使用CRISPR。这意味着张锋拥有在除细菌之外的所有生物，包括老鼠、猪和人身上使用CRISPR的权力。

但杜德娜和加州大学伯克利分校并没有就此让步，并一直积极寻找更多证据证明自己才是CRISPR的第一发现者。

CRISPR专利到底花落谁家算实至名归？张锋和杜德娜各有落脚点。杜德娜和加州大学伯克利分校认为，张锋只是诸多杜德娜论文的跟进者之一，将CRISPR运用到老鼠和人类细胞上只需要常规技术。但张锋一方的理由是：杜德娜只是预测CRISPR会在人类细胞上有效，自己是第一个将CRISPR运用到人类细胞中的人。

今年1月11日，美国专利商标局宣布重判CRISPR-Cas9的关键专利。(生物谷Bioon.com)

据《财经》杂志报道，截至2016年9月，共有32家精准医疗公司完成融资，其中A轮20家、B轮11家、C轮1家；共有9家公司得到亿元以上的融资。这当中绝大部分是基因测序公司，缺乏核心技术与较好的营业模式。围绕着基因测序是否存在“泡沫”，近期在业界掀起激烈讨论。

基因测序领域是否真的已经过热？

分享投资享投就投投资经理张耀洋对基因测序领域有深刻理解，他将在以下分享中回答几个关键问题：

• 基因测序是什么？主要应用在哪些方面？
• 行业里什么公司能够建立自己的竞争壁垒？
• 基因测序行业是否过热？

近几年，尽管国家卫计委和CFDA对基因检测临床应用市场加强了监管，但目前国内市场上已有超过200家企业和机构从事基因检测相关业务。以下是网上统计的部分现有的基因检测服务机构：

华大基因、博奥生物、贝瑞和康、诺禾致源、碳云智能、世和基因、泛生子、吉因加、百迈客生物、圣谷同创、康普森、嘉宝仁和、源宜基因、博淼生物、圣庭集团、中美泰和、斯克尔基因、华牛生物、微旋基因、安诺优达、基云惠康、爱普益、麦基诺基因、量化健康、诺赛基因、毅新兴业、博恒生物、百麦华康、华生恒业、路思达、鑫诺美迪、中科紫鑫、海克维尔、瑞德百奥、英木和、溯源精微、华弈生物、奥维森、布斯坦、信诺佰世、银河基因、华诺时代、药明康德、云健康、派森诺生物、晶能生物、美吉生物、宝腾生物、凡迪生物、佰真生物、南方基因、烈冰科技、生工生物、鼎晶生物、锐翌基因、欧易生物、翰宇生物、泛亚基因、尤尼曼、联合基因、吉玛生物、康成生物、赛安生物、吉凯基因、上海敏芯、阿趣生物、博苑生物、丰核信息、生咨生物、英拜生物、凌科生物、泉脉生物、卓立生物、达迈生物、基因科技、基龙生物、源奇生物、赛优生物、湘雅医学检验所、希匹吉生物、吉凯基因、百世嘉、派航生物、思路迪、锐翌生物、惠研生物、嘉因生物、允英医疗、虹舜生物、捷易生物、祥音生物、伯豪生物、千年基因、博大威康、易基因、海普洛斯、瀚海基因、裕策生物、蓝图基因、普元科技、早知道科技、英马诺生物、恒创基因、瑞奥康晨、华因康、达安基因、拓普基因、基准医疗、锐博生物、燃石科技、基迪奥生物、永诺生物、坤图生物、美格生物、金域检验、瑞科基因、赛哲生物、洪祥生物、贝达药业、谷禾生物、浙江天科、中翰金诺、杭州英睿、壹基金、然钠生物、晶佰生物、联川生物、奥拓生物、艾迪康医学、迪安诊断、博圣生物、菲沙基因、康圣环球、贝纳基因、生命之美、数桥科技、锦奥生物、大众源生、帕诺米克生物、金唯智生物、贝斯派生物、天昊生物、苏州生物医药创新中心、 Qiagen、赛业生物、中宜金大、亿康基因、所罗门兄弟医学、迪康金诺、广而生物、苏博生物、锐创生物、健海生物、盘古基因、天津生物芯片、国信凯尔、先导药物……

基因测序，或称DNA测序，是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是测定DNA上的腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）的排列方式。这里说基因测序主要是为了区分两个概念，基因检测和基因测序。这两个概念比较容易搞混。

基因检测包括：PCR，FISH，芯片技术，基因测序。基因测序技术是基因检测的一种。基因测序目前主要有一代测序（Sanger测序）、二代测序（illumina/Life Tech）、三代测序（单分子测序）等。

PCR、FISH和芯片技术，主要是通过已知序列去调查特定确定的片段序列或位点的有或无，重点在“检”，而基因测序技术是把基因序列上的核苷酸一个一个的测出来，重点在“测”。相比较而言，基因测序的精准度最高，随着基因测序的成本下降，最终测序技术将取代前三种技术。目前应用最广的是二代测序，即NGS。

整个基因测序行业，上游的仪器制造已经被illumina、life tech等少数几个公司垄断，中上游的试剂盒产品大部分并不具备技术壁垒，所以主要的机会都在中下游的服务应用。

基因测序应用的分类

基因测序的应用主要可以分成两部分：一部分是非人类基因组应用，另一部分可以归为与人类基因组及健康疾病相关应用。

 

（一）非人类基因组应用包括：科学研究、农业应用、环境污染监测等。

科学研究主要包括：基础科学研究、生物多样性保护。农业应用主要包括：遗传育种、食品及药材鉴定。环境监测主要包括微生物测序。这部分业务多来自政府的政策性投入。

 

（二）与人类基因组及健康疾病相关的应用主要包括：司法鉴定、消费级应用、医疗级应用三大类。精准医疗中的基因测序属于这里的医疗级应用。

1、司法鉴定

司法鉴定的需求主要来自于政府法务部门的刚需，这是一块稳定的市场，且高毛利，可以带来稳定的现金流。司法鉴定对基因检测技术要求相对于消费和医疗级应用并不高，壁垒在于政府渠道并与政府部门形成稳定的合作关系。这种类型的公司有一定的投资价值。

2、消费级应用

消费级应用的测序公司在市场上有一些，主要涉及人类的一些个性特征性基因检测如天赋基因，酒精耐受，家族起源分析等，再就是根据相关基因营养学提供保健、健身、体重控制等保健服务，还有基于相关基因的易感或慢性疾病预防。由于目前这些检测主要的依据来自于科学研究文献，但相关知识、数据积累不够，检测分析结果跟事实并没有百分百的对应关系，参考意义有限，因此消费者对相关产品的购买有非常大的弹性和不确定性，非刚性需求。

个人消费端市场目前比较混乱，没有形成规范。其中，早期开展的普通人个人基因组疾病风险预测，目前被FDA归为医疗设备进行管理，停止不具备医疗资质的公司开展相关的业务，表明了FDA对疾病风险预测业务的严谨态度。

这类公司中，代表性的如google旗下的23andMe。

消费级的应用，目前的问题在于产品不成熟和需求的不确定。这种类型的公司，如果盈利模式单单只是通过对消费者提供这种服务，很难实现盈利，投资存在一定的风险性。

但随着研究的深入，数据、知识的积累，基因与环境作用的机理的发现，在保健市场和疾病防治、慢病防治领域，有一定的市场空间。美国保健品市场在100-300亿美元，中国保健品市场规模在2000亿元，预计到2020年将达到4000亿元，在保健品服务市场上，以基因检测作为保健养生的前导服务，与传统保健服务相结合，可以对保健服务进行优化。

另外，如果这种公司，在给消费者提供消费级服务的同时，跟消费者签订协议，要求可以将其的基因组检测结果免费用于科学研究用途，那么，这类公司就会变为数据公司，后面的估值逻辑可能就变得不一样了。例如23andMe公司，这几年通过在网上销售个人基因检测服务，已经收集了超过一百万例标本数据，当然这个过程是烧了不少钱的。这一百多万例人的基因组标本是个宝库，很多药厂、医疗机构和科研院所都可能是潜在的服务客户。

如23andMe与Genentech公司合作，就向其提供部分数据库，以帮助其对3000多名帕金森患者做全基因组测序，以进行后续的相关治疗药物研发。

▲23andMe的产品资料

3、医疗级应用

医疗级应用是基因测序行业的主要应用发展方向，也是本文的讨论重点。根据市场反馈的情况以及咨询机构的测算，未来其在基因测序所有应用中所占比例会越来越大，最终将超过70%。

目前，医疗级应用主要有：生殖健康（NIPT、植入前胚胎遗传学诊断）、遗传性疾病检测、心血管疾病、感染性疾病、药物基因组学及新药研发、体检及疾病筛查、医学基础研究、肠道微生物宏基因组、肿瘤诊断及治疗等。医疗级应用的基因测序技术，是精准医疗重要的组成部分，是基因测序技术应用的热点。

这些应用，从技术上来说，可以大致分成两类，一类是验证性的检测，一类是探索性的检测。

验证性的检测已经有比较完整的知识依据和对疾病诊断的标准，如生殖健康领域的NIPT检测，有明确的诊断标准和检测SOP，主要针对13、18、21号染色体的三体检查，这类公司对技术团队的要求不高，因此市场以营销和普及为导向，尽管有一定的市场空间，但由于没有竞争壁垒，目前基本上已经没有什么再投资的价值。

而带有探索性的复杂的检测，例如肿瘤诊断及治疗，需要高通量测序，检测出的突变结果可能没有明确的标准，需要探索和研究，对团队技术要求高。

▲NIPT检测

以市场规模最大的肿瘤检测方向为例：

根据illumina的测算，在所有这些应用中，目前针对人类第一大杀手疾病——肿瘤的基因测序将会占比最高，市场需求最大。

关于国内的肿瘤测序市场规模方面，可以做个简单的测算，目前每年新增癌症患者300万人左右，且发病率呈上涨趋势。每个病人的诊疗花费大约在10万，整个市场规模大约在3000亿，而根据医疗过程中，药、检、诊所占的比例，肿瘤的基因诊断市场规模可达百亿级别。

肿瘤本身是一种基因病，肿瘤细胞的基因在不断的发生突变，肿瘤组织是动态变化的，每个时期所检测出来的基因组可能都有发生变化，目前相关的知识和数据均处在摸索和积累阶段，仍然需要不断的临床实践和研究投入。 

关于肿瘤的NGS基因检测，目前主要有两类，一类是实体瘤的突变基因组panel测序，一类是外周血的ctDNA检测。ctDNA是液体活检的一部分，液体活检还包括CTC和外泌体的检测。

开发实体瘤NGS panel的代表公司有Foundation Medicine（FMI），该公司的主要产品FoundationOne检测315个癌症相关基因的编码区和28个基因内含子的重排区，其检测方法2013年在Nature Biotechnology上发表。但正如MD-anderson癌症中心的病理专家指出，实体瘤NGS panel只是测量实体肿瘤的某一时刻的状态，而不能追踪到肿瘤发生的全过程，人体内肿瘤的状态是会随着时间不断变化的。如对于已经发生转移的癌症患者，如果仅仅取某个部位的癌组织，并不能反应患者的整体情况，但对所有癌组织都取样又不好操作。并且，实体瘤组织活检的相对滞后性对患者的治疗也不利。

▲FoundationOne的主要检测项目

ctDNA的监测则只需要外周血标本，可以实时开展。外周血中的ctDNA的含量与肿瘤负荷及肿瘤进展相关，通过NGS对ctDNA进行定量分析，可以更早的发现肿瘤的变化。

▲ctDNA检测

ctDNA另一个应用是肿瘤的早期筛查。最新的研究证明ctDNA在肿瘤早期已存在于外周血中，如果开发出高灵敏的检测方法，可以作为很好的先导指标，较影像学及其他检测更早的发现肿瘤的发生。

另外，在肿瘤的治疗过程中，ctDNA也能较好的监测肿瘤的复发及状态变化，对残留的微病灶进行（MDR）进行监控。

ctDNA的检测相对于实体瘤的NGS panel检测要求更高一些。较早进入ctDNA检测领域的代表公司如约翰霍普金斯大学创立的PGDx公司，该公司在2014年获得了无细胞DNA分析的许可，目前其在ctDNA领域有多项领先技术。

▲PGDx公司的ctDNA检测产品：PlasmaSELECT 64

目前，Illumina、塞默飞、FMI等公司均在研发ctDNA检测。如Illumina公司在2015年投资4000万美元的Grail 公司，据FastCompany报道，近期有望完成一笔17亿美元的融资该公司计划，以在英国开展涉及50万人的大型ctDNA临床试验，目的正是为了划定正常人的ctDNA基线，从而开发设计出肿瘤早筛产品。

行业里什么公司能够建立自己的竞争壁垒？

实际上，基因测序服务并非大家通常所理解的仅仅是测序，这只是其中的一步。整个过程实际上包括：样本处理（提取、建库及捕获），上机测序，架构算法及数据处理，医学注释对应解读及问题解决。

在这四个步骤中，除了上机测序只需要买illumina等公司的测序仪直接测，没有什么壁垒之外，其他三个步骤各公司之间差异大，均可形成壁垒。

以肿瘤的ctDNA检测为例，因为血液中的ctDNA含量低，捕获技术显得尤为重要。目前主要的方法有罗氏旗下的NimbleGen在2014年发布的Capp-seq技术，以及约翰·霍普金斯PGDx的Bert教授发明的Safe-SeqS技术，文后附参考文献。目前市场上做ctDNA的公司基本都是采用这两种技术。另外，贝瑞和康的cSMART捕获技术仅用于NIPT，还没有应用于肿瘤的文献及报道。上面两种技术虽然已经公开报道，但是每个公司的实验室掌握情况可能并不相同。温馨提示：87%用户都在生物谷APP上阅读，扫描立刻下载! 天天精彩！