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2016年3月9日/生物谷BIOON/–基于对人细胞中基因排布和修复方式的理解，加拿大戴尔豪斯大学医学院病理学系副教授Graham Dellaire博士开发出一种很可能能够让基因疗法更加有效和安全的技术。他的研究成果近期发表在Nature期刊和Nucleic Acids Research期刊上。
作为2015年的突破性发现，CRISPR能够准确地靶向作用于靶DNA，并对它进行编辑，从而有潜力治疗遗传病和发现新的抗癌疗法。
为了将CRISPR技术应用于非分裂细胞（non-dividing cell），科学家们首先必须让它们表现得像能够分裂的细胞。为此，他们激活一种保护DNA的被称作同源重组的细胞过程；这种重组允许人们操纵和重排细胞中的基因，同时造成的弊端还应不可能超过带来的益处。
Dellaire博士说，“人们不能够准确地修复非分裂细胞中的基因，这是因为诸如同源重组之类的基础途径[在这些细胞中]未能开启，这就不可能开展基因疗法。”
“我的同事Daniel Durocher博士和他在西奈山医院Lunenfeld-Tanenbaum研究所的研究小组已发现一种再次激活同源重组的方法，这是在非分裂细胞中进行基因编辑所需要的，但是他们需要一种方法来证明这一点。我们能够提供这方面的帮助。”
瞄准基因靶标
在戴尔豪斯大学医学院实验室中，Dhiellaire博士利用一种荧光标记技术鉴定基因靶向（gene targeting）是否在细胞（包括那些不能分裂的细胞）中取得成功。
“人们曾经认为在非分裂细胞中进行精准基因编辑是不可能的。这就是为什么Durocher博士的突破性发现和我们在Nature期刊上发表的论文产生如此深刻的影响。我们不仅首次证实在非分裂细胞中进行基因编辑确实是可能的，而且我们开发出一种筛选系统从而能够让我们持续改进基因疗法。”
Dellaire博士解释道，“我们的技术可用来测量基因编辑效率。我们知道当我们操纵的细胞发出绿色荧光，而且一种漂亮的光环出现于它的细胞核周围时，我们就成功地进行精准基因编辑。这种绿色荧光还能够让我们对样品中数以万计个细胞进行计数，我们的统计结果表明这种技术非常不错。”
在此之前，CRISPR已被用于治疗影响体内如造血干细胞之类的分裂细胞（dividing cell，即能够分裂的细胞，如干细胞）群体的疾病。
这种新的发现将使得基因疗法能够用于治疗骨骼肌系统和神经系统—它们都是由非分裂细胞组成的系统—疾病。它也可能用于抵抗某些类型的感染。
Dellaire博士说，“如果有人遭受诸如疱疹病毒之类的病毒的长期潜伏性感染，那么我们可能能够利用CRISPR基因疗法清除这种病毒。”
寻找分子
Dellaire博士说，“为了让非分裂细胞变得像分裂细胞，Durocher博士采取的方法就是敲除重要的DNA修复基因。鉴于这只能在实验室中而不能在人体内开展，我们如今一直在试图鉴定出替代这些人工基因操纵的分子。我们希望我们能够找到这样的分子，从而使得基因疗法有朝一日成功地用于治疗诸如肌肉萎缩症之类的疾病。”
寻找这些分子是全世界生物技术公司的一个活跃的研究领域。
Dellaire博士说,“我们的荧光标记体系是如此独特和高效以至于我们有机会发现这些公司可能不会发现的分子。这有点像淘金热，在合适的位点进行挖掘是非常重要的。”
通过与位于加拿大温哥华的药物研究与开发中心合作，Dellaire博士正在努力鉴定出能够被商业化和开发为药物的分子。
让基因疗法更加安全
20多年前，患有被称作重症综合性免疫缺陷（severe combined immunodeficiency）的遗传疾病的儿童是首批接受基因疗法的人群。然而，这种基因疗法导致白血病产生。
Dellaire博士回忆道，“这些儿童接受一种基于病毒的基因疗法的治疗：一种病毒被用来插入新的健康基因到DNA中以便替换他们体内缺陷的基因。这吸引了全世界；它是头版新闻。但是将病毒随机地插入基因组中，改变这些儿童的DNA，会导致突变产生。”
尽管在效率上，基于CRISPR的基因疗法仍然不足够好于基于病毒的基因疗法，但是也快了。
在发表在Nucleic Acids Research期刊上的研究中，利用Dellaire博士开发的荧光筛选体系，他已发现小分子RS-1能够提高基于CRISPR的基因组编辑效率3～6倍。然而，这种分子可能毒性太强而不适合用于病人体内，因此仍然需要发现新的分子。
Dellaire博士说，“因为利用病毒将基因插入我们的DNA中存在危险，所以我们希望我的筛选体系将有助鉴定出提高CRISPR基因编辑效率的分子。最终的目标就是替换基于病毒的基因疗法，从而让基因疗法对病人更加高效、更加可靠和更加安全。”（生物谷 Bioon.com）
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A mechanism for the suppression of homologous recombination in G1 cells
Alexandre Orthwein, Sylvie M. Noordermeer, Marcus D. Wilson, Sébastien Landry, Radoslav I. Enchev, Alana Sherker, Meagan Munro, Jordan Pinder, Jayme Salsman, Graham Dellaire, Bing Xia, Matthias Peter & Daniel Durocher
DNA repair by homologous recombination1 is highly suppressed in G1 cells2, 3 to ensure that mitotic recombination occurs solely between sister chromatids4. Although many homologous recombination factors are cell-cycle regulated, the identity of the events that are both necessary and sufficient to suppress recombination in G1 cells is unknown. Here we report that the cell cycle controls the interaction of BRCA1 with PALB2–BRCA2 to constrain BRCA2 function to the S/G2 phases in human cells. We found that the BRCA1-interaction site on PALB2 is targeted by an E3 ubiquitin ligase composed of KEAP1, a PALB2-interacting protein5, in complex with cullin-3 (CUL3)–RBX1 (ref. 6). PALB2 ubiquitylation suppresses its interaction with BRCA1 and is counteracted by the deubiquitylase USP11, which is itself under cell cycle control. Restoration of the BRCA1–PALB2 interaction combined with the activation of DNA-end resection is sufficient to induce homologous recombination in G1, as measured by RAD51 recruitment, unscheduled DNA synthesis and a CRISPR–Cas9-based gene-targeting assay. We conclude that the mechanism prohibiting homologous recombination in G1 minimally consists of the suppression of DNA-end resection coupled with a multi-step block of the recruitment of BRCA2 to DNA damage sites that involves the inhibition of BRCA1–PALB2–BRCA2 complex assembly. We speculate that the ability to induce homologous recombination in G1 cells with defined factors could spur the development of gene-targeting applications in non-dividing cells.
Nuclear domain ‘knock-in’ screen for the evaluation and identification of small molecule enhancers of CRISPR-based genome editing
Jordan Pinder1,†,Jayme Salsman1,† and Graham Dellaire
CRISPR is a genome-editing platform that makes use of the bacterially-derived endonuclease Cas9 to introduce DNA double-strand breaks at precise locations in the genome using complementary guide RNAs. We developed a nuclear domain knock-in screen, whereby the insertion of a gene encoding the green fluorescent protein variant Clover is inserted by Cas9-mediated homology directed repair (HDR) within the first exon of genes that are required for the structural integrity of subnuclear domains such as the nuclear lamina and promyelocytic leukemia nuclear bodies (PML NBs). Using this approach, we compared strategies for enhancing CRISPR-mediated HDR, focusing on known genes and small molecules that impact non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Ultimately, we identified the small molecule RS-1 as a potent enhancer of CRISPR-based genome editing, enhancing HDR 3- to 6-fold depending on the locus and transfection method. We also characterized U2OS human osteosarcoma cells expressing Clover-tagged PML and demonstrate that this strategy generates cell lines with PML NBs that are structurally and functionally similar to bodies in the parental cell line. Thus, the nuclear domain knock-in screen that we describe provides a simple means of rapidly evaluating methods and small molecules that have the potential to enhance Cas9-mediated HDR.