基因君官网本文转自科学网，作者岳东晓，二次转载需作者授权。
地球上所有细胞生物的遗传信息都储存在数字化的DNA序列中。今天，基因测序技术已经非常发达，DNA序列可以非常廉价迅速的确定。但测序只是读取数据，近年生物学最大的发现与发明之一是可编程的基因编辑技术：CRISPR-Cas9。这个技术类似于 WORD的搜索替换功能：用户输入一串字符串，程序找到匹配的字符串，然后进行删除或者替换。CRISPR-Cas9 的编辑技术里，搜索匹配字符串由实验人员通过一段 RNA表示，叫做导引 RNA — gRNA，编辑由一个称为 Cas9 的蛋白根据 gRNA 定位完成。这个编辑系统的灵活性显而易见。Cas9 蛋白是固定的，你只需要改变导引就能在不同位置对DNA进行编辑 （注一）。
CRISPR-Cas9 技术的来源是细菌的自然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。有的细菌的CRISPR系统很复杂，涉及多种 Cas 蛋白 （Cas 的意思是 CRISPR-associated — 与CRISPR相联的 ）。经过多年的研究，生物学家们终于找到了一种简单的系统，只用到一种蛋白 — Cas9。接下来，他们成功把这个细菌的系统进行改造用于动植物细胞的基因编辑。率先完成这一实际应用性开发的是张锋的研究小组。本文试图对相关技术与历史进行简单的介绍。
这里我把CRISPR之前漫长的研究历史一笔带过。简单而言，人们之前发现细菌免疫系统依靠一段很短的RNA进行识别，这段RNA称为 crRNA （CRISPR RNA）。可想而知，这段 crRNA 包含有入侵病毒的基因识别码。
CRISPR相关研究在2011年取得了重大突破。这一年，法国女科学家 Emmanuelle Charpentier 报告，通过基因分析与相关实验，发现一个只有四个组件的细菌免疫系统。除了 Csn1 蛋白（后来称为 Cas9）与 crRNA外，还发现一个他们称之为 trans-activating CRISPR RNA（简称 tracrRNA）的RNA。顾名思义，这个 tracrRNA 起到转写-启动的功能。第四个组件是一个作用于RNA的生成，称为 RNase III的蛋白。但这篇2011年的论文对各个组件的具体功能并没有完全确定。其论文中的下图显示 ：蓝色是 Cas9 蛋白，红色的是 tracrRNA， 绿色+黑色线段是 crRNA （其中绿色部分对应需要识别的病毒编码），黄色是RNase III。
Charpentier 的论文发表后，美国加州大学的 DOUDNA （“道得娜”—有些中文文章音译成“多德娜”属于错误读音）与她的研究小组隔洋合作，进行了进一步研究，于2012年6月发表了一篇重要论文。相关研究人员与主要结果如下图：
DOUDNA、Charpentier 联合小组通过在细胞体外的试管实验发现了负责DNA切割的充分并且必要的三个部分：Cas9， crRNA 与tracrRNA （不需要 RNase III）。论文还确定了三个部分的作用：其中Cas9 是切割机， crRNA 的主要作用是定位。而 tracrRNA 在与crRNA耦合后启动 Cas9 的切割功能(activate)。他们还成功把 crRNA 与tracrRNA 连起来成为一个分子，这样可以把 DNA 切割的组件由三个变成两个。如上图。左边是自然原核细菌中的机制，两个RNA分子。右边则是人工机制，把两个RNA给连起来了，成为一个带着一个配对圈的RNA分子。但 DOUDNA 等人的实验并没有在任何细胞内进行，只是在细胞体外的试管里，当然也没有在动植物等真核细胞内实验，也不知道能否可行( “it was not known whether such a bacterial system [the CRISPR-Cas9 system] would function in eukaryotic cells.”） 。在该论文发表后几个月 DOUDNA等人表示在真核细胞的实验中遇到了很多困扰（”many frustrations”）。
现在我们知道，Charpentier 2011年的论文出来后，美国东部 BROAD研究院的张锋小组也展开了研究。在Doudna/Charpentier 2012年6月论文发表前半年，张锋在2012年1月向NIH申请了一个项目：运用Cas9系统对真核细胞进行基因编辑。张锋的项目设计如下（从其项目申请截图）：
上图是一个哺乳动物 CRISPR 基因编辑系统的设计。其代码进行表达后会生成四个部分：（1）带NLS的Cas9 蛋白，（2）tracrRNA ， （3）多个 crRNA — 注意不同颜色的线段 (图中称为 guide RNA array)，(4) 带NLS的RNase III。真核细胞的特点是遗传物质在细胞核内，一般较大的蛋白是进不去的。其中 的 NLS 是为了使 Cas9 等 生成后能够被拖入细胞核内。可以这么说，张锋的思路是先不管具体机制是什么，直接在高等生物上进行基因编辑实验，而且多点编辑同时进行。
张锋小组的核心人物包括：张锋、丛乐、FEI RAN
张的小组在2013年1月发表论文，报告了他们的发现：（1）他们对四个组件进行了组合实验，发现基因编辑不需要 RNase III；（2）使用 Cas9 、crRNA 与 tracrRNA 组合，成功对真核细胞实现编辑，效率相当高（ indel 达19%）；（3）使用 DOUDNA 论文中的嵌合 RNA (chimera)，发现长的那个（chimera A ）编辑效率较双RNA系统低 (最高5.6%， 部分无法探测），短的那个 (chimera B) 不能编辑（注二）。如下图：
结论：
张锋首次将 CRISPR-Cas9 成功用于高等生物的基因编辑，其主要成果是基于2011年 Charpentier 的 tracrRNA 发现（注三）。
注一：Cas9 的工作机制是先找到 DNA上的一个特定的称为 PAM的序列，然后才是导引与DNA链的结合以及切割。所以，可行的DNA切割点不是任意的。ＰＡＭ是一个限制。不同细菌的Cas9 蛋白的ＰＡＭ序列不同，有的长些，有的只有三个字符，所以要找到可行的切割点也不是难事。
注二：后来的研究发现 组合 chimera RNA 加长后效率更高。
注三：张锋后来又发现一个 系统– CRISPR/Cpf1，蛋白比 Cas9 小，只需要crRNA（不需要 tracrRNA)， 切割位置离PAM远。
（生物谷Bioon.com)
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