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2016年12月11日/生物谷BIOON/—在一项新的研究中，来自日本名古屋大学转化生物分子研究所的两名生物学家Hiroki Tsutsui和Tetsuya Higashiyama开发出一种新的载体（一种转运遗传信息的载体），从而允许高效地和可遗传地敲除模式植物拟南芥中的靶基因。相关研究结果近期发表在Plant and Cell Physiology期刊上，论文标题为“pKAMA-ITACHI vectors for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Arabidopsis thaliana”。
基因组工程涉及对宿主基因组的一部分进行特异性修饰，即移除、添加和改变宿主基因组中的DNA序列片段。迄今为止，CRISPR/Cas9系统因其简易性、多功能性和高效性而成为一种最为流行的基因操纵方法之一。
然而，对拟南芥而言，CRISPR/Cas9的突变诱导效率在某种程度上一直都比较低。这是因为诱导基因突变的Cas9是在细胞的发育阶段后期被激活的。因此，为了获得所需的靶基因被敲除的植物物种，人们就需要大量的时间、精力和植物物种。
CRISPR/Cas9系统由两个关键的分子组成：一种被称作向导RNA（gRNA）的RNA片段和一种被称作Cas9的核酸酶。Cas9是一种分子剪刀，能够在基因组特定位点上切割DNA的双链，这样就能够在该位点上添加或移除DNA序列。另一方面，gRNA是一种事先设计好的位于一种更长的RNA骨架内的RNA片段（大约长20个碱基）。这种RNA骨架结合到DNA上，这样这种事先设计好的RNA序列引导Cas9到基因组的特定部分，因此Cas9就能够在靶位点上进行切割。
Tsutsui说，“通过使用RPS5A基因—在植物细胞的胚胎发育初期表达—的启动子，我们能够诱导Cas9高效地敲除植物卵细胞中的基因。这个RPS5A启动子在卵细胞中是有活性的，因此我们决定将这个分子工具称为pKAMA-ITACHI Red（pKIR）载体。相对于在植物中经常使用的35S启动子，该分子工具能够高效地编辑植物基因组。”
Higashiyama说，“通过能够高效地敲除拟南芥中的靶基因，我们将这种工具视为一种阐明植物基因功能的有前途的方法。我们希望我们能够利用这种方法进行欧洲油菜等作物基因组编辑，从而加快它们的生长和培育出多种植物品种。”
这种CRISPR/Cas9系统通过敲除一种特定的基因来研究它的功能。在拟南芥中，由于Cas9是在细胞的发育阶段后期表达的，因此基因敲除的程度依据组织的不同而存在差异。因此，这种基因组突变效率相对较低。
比如，当利用植物中一种经常使用的35S启动子在拟南芥中表达Cas9时，尽管在叶子中观察到大量的基因敲除，但是在花朵中仅检测到少量基因敲除。这提示着靶基因的敲除突变效率在花朵的生殖细胞中相对较低。因此，这种敲除突变很难传递到下一代的子细胞中。
为了解决这个问题，Higashiyama团队决定在植物卵细胞和胚胎发育早期期间的细胞中表达Cas9以便提高靶基因敲除效率。
Higashiyama团队首先试图敲除PDS3基因，其中已知该基因负责合成植物中的叶绿素。若缺乏叶绿素，植物变成一种白化物种。通过利用pKIR表达Cas9，Tsutsui成功地观察到PDS3基因被敲除，这可通过产生一种白化植物加以证明。
Tsutsui也研究了当PDS3基因被敲除时，它对叶绿素在花茎中的合成数量的影响。当利用35S启动子表达Cas9时，叶绿素数量与野生型中观察到的数量仅有微量的差别。另一方面，当利用pKIR诱导Cas9表达时，叶绿素数量显著下降，这提示着该基因被高效地敲除。
Higashiyama团队也发现pKIR载体成功地敲除拟南芥中的其他基因，如AGAMOUS、DUO1和ADH1。
为了容易地鉴定出携带CRISPR/Cas9基因的植物物种，含有Cas9的种子利用红色荧光加以标记。
Higashiyama团队发现利用pKIR载体表达Cas9对拟南芥基因组进行高效编辑的方法能够敲除早期发育阶段期间的细胞中的基因，并且诱导能够传递到下一代的子细胞中的突变。
Tsutsui说，“这种pKIR方法允许我们研究可能具有重叠功能的基因簇。在此之前，我们不得不通过让现存的突变株进行杂交产生多种基因敲除植物来研究重叠的基因功能，这非常耗费时间。利用我们的相对低成本的方法，我们能够快速地获得突变株，从而应当能够研究未被鉴定出的基因簇的功能。”（生物谷 Bioon.com）
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pKAMA-ITACHI vectors for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Arabidopsis thaliana
Hiroki Tsutsui and Tetsuya Higashiyama