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基因编辑技术CRISPR/Cas系统因其操作简便、能高效精准的在特定位点对DNA进行切割和编辑，近年来一直是生物技术领域的研究热点。CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，用来对抗病毒和外源DNA的入侵。其中Cas (CRISPR associated protein)是一种核酸内切酶，在含有与靶标DNA互补序列的向导RNA的指引下识别DNA的特定位点并进行切割，形成双链DNA缺口，随后细胞借助同源重组或者非同源末端连接机制对断裂的DNA进行修复，从而形成DNA插入或移除的突变，实现基因编辑。
RNA介导的CRISPR/Cas9系统定向基因组修饰作用机制示意图
虽然基于CRISPR的基因编辑系统，在许多人类疾病的小鼠模型中显示了极大的治疗潜力，但Cas9在诱导DNA双链断裂(DNA double-strand breaks，DSBs)的过程中可能脱靶，引入未知的突变，对病人造成伤害，限制了其临床应用。
改进的CRISPR/Cas9技术
《Nature Reviews Genetics》高级编辑Darren J. Burgess近期撰文“Translational genetics： CRISPR therapies – making the grade not the cut”，点评了美国Salk生物研究所Juan Carlos IzpisuaBelmonte课题组研究人员利用改进的CRISPR/Cas9技术介导转录-表观遗传调控，在小鼠体内激活多个靶基因的工作。
Juan Carlos Izpisua Belmonte课题组改进的CRISPR/Cas9系统图示
利用CRISPR系统对转录进行调控，通常需要将不具有核酸酶剪切功能的Cas9 (dCas9)与能调节转录的蛋白区域进行融合，该蛋白区域可以是转录激活因子、转录抑制因子或是组蛋白修饰酶。随后该融合蛋白被设计好的单导向RNA (single-guide RNA， sgRNA)引导到靶基因的位置。由于最适合基因治疗的载体是腺相关病毒 (AAV)，但腺相关病毒的负载容量有限，无法承载典型dCas9融合蛋白的编码基因。为了克服dCas9/sgRNA和协同转录激活复合物的编码序列超出了通用AAV容量的技术难题，Juan Carlos Izpisua Belmonte课题组研究人员对CRISPR/Cas9系统进行了改进。
单导向RNA(sgRNA)的改进
首先他们改进sgRNA，引入MS2回路，使其不需要与Cas9融合，就能以独立方式募集转录激活蛋白MS2–P65–HSF1 (MPH)；其次，他们缩短了sgRNA的序列长度(用14或15个碱基对代替20个碱基对)，使其即使与野生型Cas9结合形成复合物，该复合物也不会对靶基因进行切割(研究人员把这些sgRNA称作dgRNAs)。利用上述改进，研究者可以方便的把基于CRISPR的转录激活组分编码进2个AAV：一个编码dgRNA和转录激活蛋白MPH，另一个编码Cas9，让sgRNA结合转录激活蛋白MPH辅助Cas9工作。
CRISPR/Cas9技术改进后的效果
随后，研究小组在多个小鼠疾病模型中测试了这一系统是否能减轻疾病症状。在大多数实例中，他们首先利用细胞培养来确定能够有效激活靶基因的dgRNAs，随后用一个AAV载体将dgRNA和MPH一同输入到表达野生型Cas9的转基因小鼠体内(或是通过血液注射或是局部注射进相应的器官)。通过实验，他们证明了上调白介素(Il10)或klotho (Kl)基因表达能够减轻顺铂诱导的肾损伤；上调肝脏中的胰十二指肠同源异型盒基因1 (pancreatic andduodenal homeobox gene 1，Pdx1) 能诱导肝细胞向分泌胰岛素的细胞转分化并部分缓解链脲霉素诱导的高血糖 (小鼠I型糖尿病模型)； 上调utrophin (Utrn)基因，无论在新生期还是疾病发生后，在杜氏肌营养不良(由肌萎缩蛋白基因功能失调引起)mdx基因模型中都能缓解肌无力。
这一研究中，能够过度表达像utrophin这样的大基因是引人注目的， 因为cDNA的大小超出了大多数载体的装载能力， 通过标准的基因治疗方法很难实现。在表达Cas9的小鼠体内证明了上调卵泡抑制素(Fst) 能增加肌肉质量后，作者又证明了同时向肌肉注射编码dgFst–MPH和Cas9的AAV或编码dgUtrn–MPH和Cas9的AAV，在不表达Cas9的mdx小鼠模型中也能缓解肌无力症状。
Cas9变体：野生型Cas9 or dCas9
弄明白野生型Cas9和dCas9(即不具有核酸酶剪切功能的Cas9)，哪一个是更合适的Cas9变体，将是非常有趣的。Juan Carlos Izpisua Belmonte课题组的研究显示，在同一个实验中，野生型的Cas9和dCas9对Fst具有相同的转录激活作用。虽然利用Surveyor测试和深度测序，他们没有检测到野生型Cas9诱导的DNA双链断裂，但dCas9在不引起DNA双链断裂方面有双重保险，如果dCas9能在更多的实验中被证明具有和野生型Cas9相当的转录作用，那么将来dCas9可能会是更好的变体。
改进后的CRISPR/Cas9系统在小鼠糖尿病、肌肉萎缩症和急性肾病等模型中均显示出了治疗效果。尽管我们对其疗效能否长期保持还存在一些疑问：例如，一次注射后转录调节能持续多久，多次注射后作用效果是否会因为机体对AAV的免疫反应或AAV的荷载问题而逐渐减弱，但这一系统为将来更好的用于治疗人类疾病奠定了良好的基础。