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2018年9月14日/生物谷BIOON/—在临床中使用CRISPR/Cas9基因编辑的一个障碍是Cas9核酸酶可能会在错误的位点上切割DNA。在一项新的研究中，来自美国麻省总医院和英国阿斯利康公司的研究人员描述了一种在整个基因组中预测这些脱靶突变的策略，并且在小鼠中证实经过精心设计的向导RNA（gRNA）链不会产生任何可检测到的切割错误。相关研究结果于2018年9月12日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations”。论文通信作者为阿斯利康公司生物学家Marcello Maresca和麻省总医院生物学家与病理学家J. Keith Joung。
加拿大多伦多大学发育生物学家Janet Rossant（未参与这项研究）说，这项研究证实“你最好确保你拥有非常准确的gRNA”。她补充道，“这种方法是一种更好的在动物模型和人体中开展实验之前测试一种gRNA的特异性的方法。”
根据Maresca的说法，他所在的公司的一个长期目标是能够使用治疗性基因编辑来治疗许多人类疾病。他在一封发送给《科学家》网站的电子邮件中写道，“然而，实现CRISPR药物的潜力需要开发能够高效地修饰靶基因的方法，而且这不会对基因组中的其他地方产生任何影响。”
脱靶切割能够发生在对有机体没有影响的基因组位点上，或者它们能够破坏重要的细胞功能。当试图预测Cas9可能会出错的基因组位点时，科学家们通常从计算预测开始，但是这些计算预测依赖于针对它们的gRNA如何结合DNA和Cas9如何进行切割作出的假设。
美国布朗大学神经科学家Kate O’Connor-Giles（未参与这项研究）说，“看到一种通过实验手段确定脱靶位点的方法是激动人心的，这是因为这种方法不存在针对构成潜在脱靶位点的因素作出假设时引入的偏差。”
为了开发出一种让脱靶效应最小化的方法， Maresca团队与Joung团队合作。他们开发出的这种方法的第一部分—最初由Joung团队开发并于2017年发表（Nature Methods, doi:10.1038/nmeth.4278）—是在体外完成的。首先，他们将基因组DNA —在这项新的研究中，他们用的是小鼠基因组—切割为大约长300个碱基对的片段，随后给这些片段连接上一系列让DNA环化的接头（adapter）。他们引入Cas9和gRNA的复合物，这种复合物在某些位点上切割环状DNA，从而让它线性化。
另一批核酸酶会降解剩余的未被切割的环状DNA。通过这种方式，这些研究人员能够对线性化的DNA进行测序，以便观察Cas9切割（不论是有意的还是无意的）的位点并预测gRNA是否会导致体内脱靶效应。
作为在这项新的研究中开发出的这种方法的第二部分，这些研究人员在小鼠中测试了他们的预测结果。当他们使用他们在体外发现的会在基因组中数千个错误位点进行切割的gRNA时，在他们检查的一部分的预测位点中，超过40％的位点也在小鼠肝脏中发生突变。一个位点在体外筛选中出现的频率越高，它在体内发生突变的可能性就越大。换句话说，在体外发生差错的gRNA在体内也会发生差错。
这些研究人员还在体内实验中检查了小鼠基因组中的通过计算预测可能为脱靶位点但是迄今为止并未在他们的体外筛选过程中出现的位点。他们并没有在这些位点上检测到突变，这意味着他们的体外方法可能不会错过真正的脱靶位点。
对这些研究人员预测对靶位点具有高度特异性的另一种gRNA而言，他们在182个预测的位点中都未发现体内可检测到的突变。
O’Connor-Giles说，“真正的进步是检测有机体特异性脱靶切割的实际能力，而不是依赖于并不一定反映你在正在使用的有机体（在临床环境中，指的是患者）的遗传环境的参考基因组序列。”鉴于使用来自特定患者或有机体体的基因组DNA进行体外筛选是可能的，因此来自测序步骤的序列读取反映了测试对象基因组中可能存在的Cas9靶标。”
Joung说，“这项[研究]应当会鼓励进一步开发体内疗法。它还为人们如何在整个有机体或体内环境中观察这些潜在的脱靶位点提供了重要的蓝图或途径。这一点是非常重要的，这是因为—尤其是出于研究目的—它让你能够评估对策略进行改善特异性的更改是否具有预期效果。”（生物谷 Bioon.com）
参考资料：
Pinar Akcakaya, Maggie L. Bobbin, Jimmy A. Guo et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature, Published Online: 12 September 2018, doi:10.1038/s41586-018-0500-9.