干细胞基因编辑领域最新研究进展

从1957年世界上第一例骨髓移植技术成功救治一位重症联合免疫缺陷患者到现在，干细胞技术的发展已经长达半个世纪之久，在这几十年的研究中，科学家们一次次地见证了奇迹的诞生，干细胞治疗也逐步由实验室研究走向临床试验，大家期待的“干细胞治疗新时代”即将到来。据不完全统计，如今干细胞已经能够治疗以及正处于临床试验阶段的疾病达到140种。全世界已经保存了200多万份干细胞，并进行了数万例干细胞移植术，国际上已有10几个干细胞产品上市。随着近年年来科学家们研究的不断深入，他们开始使用干细胞疗法治疗多种人类疾病，比如癌症、糖尿病、神经变性疾病、脊髓损伤以及多发性硬化症等。如今越来越多的临床案例表明，干细胞技术对人类医疗发展有着划时代的意义，世界各国纷纷将干细胞列为在人类健康领域提高国际竞争力的战略性新兴产业。

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在干细胞疗法飞速发展时，又有一种新型技术因能表现出强大的治疗潜力而进入大家的视野，那就是基因编辑技术，基因编辑技术是一种能对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、掺入的一种技术；未来科学家们对人体基因进行有效编辑有望治疗一系列人类疾病。此前科学家们仅能通过物理、化学诱变和同源重组等方式对目标DNA进行编辑，然而这些方法靶向位点较为随机，且耗时耗力。在过去几年里研究人员开发出了锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases， ZFN）和转录激活因子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases， TALEN）两种技术，这两种特殊的序列特异性核酸酶技术能够实现高效定点的基因组编辑功能， 其在基因治疗等领域展示出了巨大的潜力，曾经一度成为科学家们所使用的主流基因编辑技术，然而随着ZFN和TALEN技术的广泛应用，其所带来的问题不断出现，主要表现为操作繁琐、周期较长、脱靶率较高等缺陷，这无疑严重制约着基因编辑技术在人类疾病治疗领域的发展。

2013年，随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的问世，立刻掀起了全球科学家的研究高潮，该技术被认为是继ZFN和TALEN之后的第三代基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统包括两个元件，分别是Cas9内切酶和guide RNA(gRNA)，gRNA引导Cas9蛋白在靶位点进行切割，形成 DNA双链断裂(DSB)，该技术能够帮助研究人员快速而精确地对核苷酸序列进行编辑，不仅操作较为简单方便，而且成本也较低。未来CRISPR/Cas9技术的另一个诱人的应用就是通过对机体体细胞基因组进行编辑，来治疗多种人类遗传性疾病，而通过纠正诱发疾病的突变就有可能逆转患者疾病的症状。近年来，科学家们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在治疗多种疾病上取得了重要的研究进展，2018年2月，刊登在国际杂志Science Advances上的一篇研究报告中，科学家们通过研究利用CRISPR/Cas9技术对杜氏肌营养不良（DMD）症患者机体的多能干细胞进行改造产生了健康的心肌，有望治疗杜氏肌营养不良症患者[1]；同一个月，刊登在Cell杂志上的两篇研究报告中，来自怀特黑德生物医学研究所的研究人员利用一种基于CRISPR/Cas9的技术成功治疗了脆性X染色体综合征[2]；2018年4月，一项刊登在国际杂志Nature Genetics上的研究报告中，来自斯坦福大学的科学家们将CRISPR基因编辑技术同DNA条形码技术结合有效地对癌症的进展进行了追踪，这种组合性的方法对于未来研究人员进行癌症药物检测非常重要[3]。

随着研究的深入，科学家们开始对干细胞进行基因编辑，而该技术也是近年来出现的一项新兴技术，其在治疗多种人类疾病上有着巨大的潜力，但同时其安全性也引起了很多人的担忧，比如就有人会担心基因编辑会降低干细胞的稳定性，促进其发生突变，随着科学家们多项研究成果的刊登，渐渐地打消了人们的顾虑。那么近些年来，科学家们在干细胞基因编辑领域到底取得了哪些重要成果呢？此前，来自英国桑格研究所和剑桥大学的研究人员首次结合基因编辑技术对患者机体自身诱导干细胞（induced stem cell）的基因突变进行编辑，修正了一种代谢性肝病患者细胞中的基因突变，这一研究进展开或能帮助重新调整患者自身的细胞，从而成功治疗遗传病[4]。过去10年里诞生了两种非常有用的生物学工具，第一个就是人类诱导多能干细胞（iPSCs），而第二项工具就是CRISPR-Cas9系统，将两种工具相结合，即利用CRISPR编辑人类诱导多能干细胞就能帮助科学家们研究特殊疾病背景下的基因功能，或者能够有效纠正病人细胞中的遗传缺陷。尽管CRISPR-Cas9和人类iPSCs已经成为研究者在实验室中老生常谈的话题了，但对两者进行统一却并不容易，想要研究基因功能的科学家如今正在发现，在培养基中很难维持人类ipsCs，而且也很难利用CRISPR进行操作。

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当利用CRISPR-Cas9切割基因时，两个主要的分子途径就会开启来进行DNA修复，而且最终会确定随后编辑作用的保真性，这两个修复通路同时会发生，用作基因敲除的非同源性末端接合（NHEJ）能够在DNA中产生小型的插入位点或剔除位点来阻断基因的功能；另外一种名为同源性直接修复（HDR）的作用则会基于供体的长链DNA来产生精确的核苷酸改变。目前研究者Hockemeyer及其同事正在开发新型策略来使得同源性直接修复发挥主要作用，比如应用特殊的化学物或利用来自不同物种的Cas9酶等。而研究者Conklin等人开发出了一种快速的数字PCR技术，其能够对HDR和NHEJ的修复率进行定量，在包括人类ipsCs的多个细胞类型中，上述两种修复率并没有互相关联，这就表明，相比单单测定一种修复率而言，同时测定两种修复率是非常明智的，尤其是当目标是HDR的时候[5]。

2017年1月，一项刊登在Science Translational Medicine杂志上的研究报告中，来自美国国家过敏症和传染病研究所等机构的研究人员研究人员利用基因编辑工具成功修复了源自X连锁慢性肉芽肿病患者体内造血干细胞中的一种缺陷基因。当移植到小鼠体内后，这些经过修复的造血干细胞产生功能正常的白细胞，这就提示着这一策略可能潜在能被用来治疗X连锁慢性肉芽肿病患者[6]。随后2017年4月27日发表在Stem Cell Reports杂志上的一篇研究报告中，来自华盛顿大学的研究人员实现了成功利用CRISPR编辑干细胞来抵抗关节炎的目标；文章中研究人员利用新型基因编辑技术改造小鼠的干细胞，使其能够抵抗关节炎等慢性疾病导致的炎症。这些经过改造的干细胞（SMART细胞，干细胞经修饰用于自主再生疗法）能产生制造一种抗炎性生物制剂药物的软骨细胞，在理想情况下这些软骨细胞能够替换关节炎性软骨，保护关节和其它组织免受慢性炎症中诱发的损伤[7]。

如今研究人员利用基因编辑技术在生殖干细胞领域也取得了重要的研究成果，来自中科院上海生命科学研究院的李劲松博士长期从事于体细胞重编程与胚胎发育相关领域的研究，2012年，他们建立了只携带精子来源遗传物质的小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞，并证明这一细胞能代替精子在注入卵母细胞后能支持胚胎发育产生健康的半克隆小鼠（半克隆技术）。然而单倍体细胞的“受精”能力随着细胞的传代逐渐丢失，特别是经过基因编辑后，这些细胞再注入卵子中很难获得健康半克隆小鼠。最近，李劲松团队通过将调控雄性印记基因H19和Gtl2表达的H19-DMR和IG-DMR敲除后获得了能稳定产生半克隆小鼠的“人造精子”，这一研究突破将不断推动科学家们在生殖医学领域的研究进展。

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2017年3月，刊登在国际杂志Oncotarget上的一篇研究报告中，来自中国中南大学的科学家们发表了他们在基因编辑干细胞抑制肿瘤生长研究领域的新进展，文章中，研究人员尝试建立高效稳定表达抗癌因子的病人特异性的人诱导多能干细胞，从而诱导分化为间充质干细胞，用于肿瘤的自体化基因治疗，这项研究成果首次证明通过非病毒基因打靶病人特异性人诱导多能干细胞获得自体间充质干细胞用于癌症治疗的可行性，展示了基因编辑人诱导多能干细胞在肿瘤自体化基因治疗领域的临床应用前景[8]。同年7月刊登在国际杂志Cell Research上的一篇研究报告中，来自中科院生物物理所刘光慧等研究人员成功实现了通过单碱基基因编辑重塑超级干细胞的目的，文章中，研究人员利用基因编辑改写了人类基因组遗传密码中的单个碱基，首次在实验室中获得了遗传增强的“超级”干细胞（Genetically Enhanced Stem cells，GES细胞）。这种GES细胞能够对细胞衰老和致瘤性转化产生双重抵抗作用，因此为开展安全有效的干细胞治疗提供了可能的解决途径。这一发现对间充质干细胞的临床转化治疗具有重要的价值，同时也很好地证实了利用基因编辑技术可以促进干细胞在再生医学中的应用，为干细胞研究提供了值得借鉴的新方法[9]。

2018年3月，来自日本京都大学等处的研究人员通过研究开发了一种新型的基因编辑方法，其能够以较高的准确度修饰人类基因组中单个DNA碱基，这种新方法的特殊之处在于其能够指导细胞自身的修复机制，从而就能为研究疾病相关的突变提供一对基因匹配的细胞。目前研究人员正在利用胚胎干细胞进行人类糖尿病临床试验，但需要对患者进行慢性的免疫抑制，对患者自身的ips细胞进行基因修正或许能够帮助产生健康的胰腺细胞，同时还能降低患者移植后出现的排斥反应和概率。最后研究者Woltjen表示，我们的目标就是能开发出改善对疾病发病机制理解的新型基因编辑技术，最终开发出根治疾病的新型疗法，我们相信，MhAX技术在目前多种人类疾病研究中将具有更为广泛的适用性[10]。4月份，来自浙江大学的研究人员通过研究建立了对人多能干细胞进行更高效和精准的基因编辑技术体系—CRISPR-Cpf1技术，研究人员表示，CRISPR-Cpf1基因编辑系统能与小分子药物进行组合，实现对人多能干细胞进行更加简单、高效和精准的基因编辑，从而更好地应用于基础生物学研究、疾病模型构建、药物筛选和临床转化[11]。同一个月，发表在PLOS Pathogens杂志上的一篇研究报告中，来自国外的研究人员通过研究表示，利用基因编辑的干细胞或许有望消除HIV，文章中，研究者表示，使用基因编辑的骨髓干细胞可以显著降低感染猴/人免疫缺陷病毒（SHIV）的猪尾猕猴休眠的“病毒水库”的大小[12]。

2018年5月刊登在Nature Cell Biology杂志上的一篇研究报告中，科学家们利用基因编辑技术以及人源胚胎干细胞技术绘制出了人类基因组的蓝图，揭示了基因对人体健康以及疾病发生的作用。研究人员通过生成180000种不同的突变，对人类基因组中的所有基因功能进行了分析。其中，他们构建出了一种仅存在一对染色体的新型胚胎干细胞，并使用了CRISPR-CAS9技术进行大规模突变体的筛选[13]。此前一项发表在Cell Stem Cell杂志上的研究报告中，来自美国斯坦福大学等机构的科学家们成功利用CRISPR修饰表观基因组产生了诱导性多能干细胞，文章中，研究者发现，一种能够激活而不是切割DNA的CRISPR形式能够将胚胎小鼠细胞转化为诱导性多能干细胞[14]。2018年6月，刊登在国际著名杂志Cell上的一篇研究报告中，来自美国的科学家们利用CRISPR/Cas9技术成功改造造血干细胞，促进CAR-T细胞疗法有效治疗急性髓性白血病，文章中，研究者开发出了一种新方法，能利用CAR-T细胞来治疗急性髓性白血病（AML），为了能治疗这种白血病，目前研究人员会靶向作用健康细胞中表达的一种名为CD33的特殊蛋白，这种疗法并不能在不造成患者其它正常骨髓损伤的情况下来成功攻击癌症，而本文研究中研究者所开发的新方法则利用基因编辑工具CRISPR/Cas9来移除健康造血干细胞中的CD33分子，从而攻击携带该分子的癌变细胞[15]。

近年来，科学家们在干细胞基因编辑领域取得了大量的研究进展，相信未来通过科学家们更为深入的研究必将能开发出更多有效治疗多种人类疾病的新型干细胞基因编辑手段；近年来，在国家政策的大力支持下，我国干细胞产业发展迅猛，如今已经形成了全产业链模式，预计到2021年，我国干细胞相关市场规模将接近1500亿元。然而与国外相比，我国干细胞发展的步伐还需加快，除了聚焦干细胞及转化研究的重大基础科学问题和瓶颈性关键技术，我们还要争取在优势重点领域取得科学理论和核心技术的原创性突破，推动干细胞研究成果向临床应用的转化，整体提升我国干细胞及转化医学领域技术水平。为此，生物谷将于2018年11月9日至2018年11月10日在北京举办第十届干细胞国际研讨会，本届干细胞国际研讨会在秉承此前干细胞临床与转化的会议经验基础上，我们围绕干细胞重编程与再生医学、干细胞临床研究即干细胞商业化等多个领域，邀请国内外知名专家学者、业界翘楚、临床医生一道进行深入讨论，促进合作交流。同时本次研讨会特别设立“青年千人”论坛，为海内外优秀青年学者搭建学术交流平台。

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本次干细胞国际研讨会已邀请中科院广州生物与健康研究院裴端卿教授、仁济医院的管阳太主任、浙江大学遗传学研究所徐鹏飞研究员、乔治城大学刘学锋教授等知名干细胞领域研究者，届时我们将会在干细胞基因编辑、多能性、干细胞与多种疾病关联等领域进行深入交流探讨，裴端卿教授主要研究主要研究领域为干细胞的多能性维持与体细胞重编程，细胞内蛋白与膜运送机制，其代表性学术成果发表在Nature，PNAS， JBC 等国际期刊上，共计50多篇研究论文，引用达2000余次。2017年，裴端卿教授和舒晓东教授通过联合研究，报道了关于调控人胚胎干细胞向肝系细胞分化的机理，相关研究成果为多能干细胞分化提供细胞生物学的机理，为解决干细胞在再生医学运用中打开一扇新门窗；与此同时，在统一体细胞重编程与干细胞分化这两个看似相反过程的机理研究中迈出一大步，促进细胞命运调控理论体系的建立[16]。2017年10月，裴端卿教授以及来自加州理工学院等处的多位学者在Cell Stem Cell杂志上刊登了一篇题为“Human Embryo Editing： Opportunities and Importance of Transnational Cooperation”的研究报告，论述了科学界通过组织人类基因编辑委员会和国际学术峰会为人类基因编辑，尤其是可遗传的胚胎基因编辑提供详细的指导意见的努力，并着重描述了人类胚胎基因编辑对于胚胎发育等基础研究的重要推动作用，以及国际学术合作对人类胚胎基因编辑的潜在临床应用的重要意义[17]。2018年4月，裴端卿教授在Cell Stem Cell发表最新研究研究成果，文章中研究者表示，他们开发了简单、高效、标准化制备干细胞的方法，即一种名为化合物诱导干细胞多能性的技术（CIP，Chemical Induction of Pluripotency），该技术能为诱导多能干细胞的研究和优化制备途径提供了全新的科学视角和解决方案[18]。

其他已邀请的嘉宾也在干细胞研究领域取得了多项成果和项目，比如2018年5月，由仁济医院神经内科科主任管阳太牵头的干细胞多中心临床研究项目《脐带源间充质干细胞治疗视神经脊髓炎谱系疾病的前瞻性多中心随机对照研究》按照《干细胞临床研究管理办法（试行）》的规定完成了国家卫健委备案。仁济医院神经内科牵头开展的临床研究是首个将人脐带源间充质干细胞（hUC-MSC ）治疗视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的大型多中心临床试验，探讨人脐带源间充质干细胞治疗NMOSD的安全性和有效性，为该新疗法在临床治疗应用提供循证医学证据。

2018年11月9-10日，我们将相聚北京召开第十届干细胞国际研讨会，会议上我们将围绕干细胞重编程、干细胞临床研究、干细胞规模化制备，监管等多个领域，与国内外知名专家学者、业界翘楚、临床医生一同深入讨论，促进合作交流，快来参会吧！

参考资料：

【1】Chengzu Long， Hui Li， Malte Tiburcy， et al. Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing. Science Advances  31 Jan 2018： Vol. 4， no. 1， eaap9004 DOI： 10.1126/sciadv.aap9004

【2】X. Shawn Liu， Hao Wu， Marine Krzisch et al. Rescue of Fragile X Syndrome Neurons by DNA Methylation Editing of the FMR1 Gene. Cell， Published online： February 15， 2018， doi：10.1016/j.cell.2018.01.012

X. Shawn Liu， Hao Wu， Xiong Ji et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell， 22 September 2016， 167(1)：233-247， doi：10.1016/j.cell.2016.08.056

【3】Zoe N. Rogers， Christopher D. McFarland， Ian P. Winters， et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics (2018) doi：10.1038/s41588-018-0083-2

【4】Yusa K， Rashid ST， Strick-Marchand H， et al. Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 2011 Oct 12；478(7369)：391-4. doi： 10.1038/nature10424

【5】Yuichiro Miyaoka，Jennifer R. Berman，Samantha B. Cooper， et al. Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effects of locus， nuclease， and cell type on genome-editing. Sci Rep. 2016； 6： 23549.doi：10.1038/srep23549.

【6】Suk See De Ravin， Linhong Li， Xiaolin Wu， et al. CRISPR-Cas9 gene repair of hematopoietic stem cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Science Translational Medicine  11 Jan 2017：Vol. 9， Issue 372， eaah3480 DOI： 10.1126/scitranslmed.aah3480

【7】Jonathan M. Brunger， Ananya Zutshi， Vincent P. Willard et al. Genome Engineering of Stem Cells for Autonomously Regulated， Closed-Loop Delivery of Biologic Drugs. Stem Cell Reports， Published Online： 27 April 2017， doi：10.1016/j.stemcr.2017.03.022

【8】Bo Liu，Fei Chen，Yong Wu， et al.Enhanced tumor growth inhibition by mesenchymal stem cells derived from iPSCs with targeted integration of interleukin24 into rDNA loci. Oncotarget. 2017； 8：40791-40803. doi： 10.18632/oncotarget.16584.

【9】Jiping Yang， Jingyi Li， Keiichiro Suzuki， et al. Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by a single nucleotide recoding. Cell Research volume 27， pages 1178–1181 (2017) doi：10.1038/cr.2017.86.

【10】Shin-Il Kim， Tomoko Matsumoto， Harunobu Kagawa， et al. Microhomology-assisted scarless genome editing in human ipsCs. Nature Communications  (2018)  doi：10.1038/s41467-018-03044-y

【11】Ma X， Chen X， Jin Y，et al. Small molecules promote CRISPR-Cpf1-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Nat Commun. 2018 Apr 3；9(1)：1303. doi： 10.1038/s41467-018-03760-5.

【12】Peterson CW， Wang J， Deleage C， Reddy S， Kaur J， Polacino P， et al. (2018) Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs： Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathog 14(4)： e1006956. doi.org/10.1371/journal.ppat.1006956

【13】Atilgan Yilmaz， Mordecai Peretz， Aviram Aharony， Ido Sagi， Nissim Benvenisty. Defining essential genes for human pluripotent stem cells by CRISPR–Cas9 screening in haploid cells. Nature Cell Biology， 2018； DOI： 10.1038/s41556-018-0088-1

【14】Peng Liu， Meng Chen， Yanxia Liu et al. CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency. Cell Stem Cell， Available online 18 January 2018， doi：10.1016/j.stem.2017.12.001

【15】Miriam Y. Kim， Kyung-Rok Yu， Saad S. Kenderian， et al. Genetic Inactivation of CD33 in Hematopoietic Stem Cells to Enable CAR T Cell Immunotherapy for Acute Myeloid Leukemia. Cell (2018) doi：10.1016/j.cell.2018.05.013

【16】Qiuhong Li， Andrew P. Hutchins， et al. A sequential EMT-MET mechanism drives the differentiation of human embryonic stem cells towards hepatocytes. Nature Communications volume 8， Article number： 15166 (2017) doi：10.1038/ncomms15166.

【17】Duanqing Pei，David W. Beier，Ephrat Levy-Lahad， et al. Human Embryo Editing： Opportunities and Importance of Transnational Cooperation. Cell Stem Cell， OCTOBER 05， 2017， doi：10.1016/j.stem.2017.09.010.

【18】Shangtao Cao，Shengyong Yu，Dongwei Li，et al. Chromatin Accessibility Dynamics during Chemical Induction of Pluripotency. Cell Stem Cell，APRIL 05， 2018. doi：10.1016/j.stem.2018.03.005