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2019年9月15日讯/生物谷BIOON/—在一项新的研究中，通过使用一种基于CRISPR的基因筛选方法，来自英国弗朗西斯-克里克研究所的研究人员鉴定出弓形虫在小鼠体内存活的关键基因。相关研究结果近期发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“A CRISPR platform for targeted in vivo screens identifies Toxoplasma gondii virulence factors in mice”。
这项研究提供了一种灵活的新方法，可用于扩大CRISPR筛选的使用范围。这种方法还允许在小鼠体内同时测试弓形虫的数百个基因，从而极大地减少了所使用的研究动物的数量。
用于CRISPR筛选的通用文库生成
CRISPR筛选是鉴定基因功能的极其有效的方法。通过使用向导RNA（gRNA），特定基因被靶向“敲除”。这种敲除有助于确定哪些基因对于细胞存活至关重要。然而，这些筛选通常在全基因组范围内进行，而且这种规模会限制人们可以做的实验类型。
为了克服全基因组筛选的局限性，这些研究人员开发了一种新方法，即使用单步克隆方法快速生成和分析不同大小和组成的自定义CRISPR文库。
论文通讯作者、弗朗西斯-克里克研究所的Moritz Treeck说，“这种构建和分析仅靶向一部分基因的gRNA库的方法使得我们能够更快地执行CRISPR筛选并将它们转移到体内感染模型中。”
靶向感兴趣基因的gRNA是从一组序列中选择出来的，随后将它们克隆并组装到合并的CRISPR文库中。随后将这种自定义的CRISPR文库转染到弓形虫中以产生突变体库，接着在小鼠或细胞培养物中培养这些弓形虫突变体。通过对输入和输出的突变体库进行测序，我们能够识别那些在任何选择条件下对生长都很重要的基因。”
新基因
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种影响大约三分之一人口的寄生虫。虽然在健康的个体中几乎没有与感染相关的症状，但是弓形虫对艾滋病患者和子宫中的儿童发育是严重的威胁，而且引起眼部疾病的致病性弓形虫虫株在南美洲是普遍存在的。在此之前，全基因组基因筛选已在体外被用来识别在体外培养的细胞中生长所需的基因，但是目前还没有筛选方法来识别那些对调节宿主免疫反应和确保在体内存活至关重要的称为“毒力因子（virulence factor）”的基因。
论文共同第一作者、弗朗西斯-克里克研究所博士后研究员Joanna Young说，“通过选择一部分基因进行靶向，我们不会在弓形虫能够繁殖之前冒着压倒宿主的风险。我们用弓形虫突变体库感染小鼠，我们预测它们会与宿主发生相互作用。这揭示了新的毒力因子，并证实了之前的研究中已知的那些毒力因子。”
有趣的是，这些研究人员还发现，一些无法自行存活的弓形虫虫株在混合的突变体库感染的小鼠中能够成功地存活下来。
Joanna解释道，“比如，MYR1基因是许多弓形虫分泌蛋白发挥功能所必需的，如果没有它，这种寄生虫就无法发起感染。但是，我们吃惊地发现当与其他的突变体一起感染小鼠时，MYR1敲除突变体仍然能够在小鼠中存活下来。如今，我们需要找出这种情况是如何发生的。”
下一步
下一阶段的研究已在进行中。这些研究人员想要识别单个CRISPR突变体和受感染宿主细胞的完整RNA，以确定特异性干扰宿主反应的毒力因子。（生物谷 Bioon.com）
参考资料：
1.Joanna Young et al. A CRISPR platform for targeted in vivo screens identifies Toxoplasma gondii virulence factors in mice. Nature Communications, 2019, doi:10.1038/s41467-019-11855-w.
2.Novel CRISPR method identifies key genes for Toxoplasma survival
https://phys.org/news/2019-09-crispr-method-key-genes-toxoplasma.html